Costruzione di un modello murino umanizzato con immunità ingegnerizzata contro l'HIV

Preparare un topo ricevente anestetizzato gravemente immunocompromesso.

Fai un'incisione per esporre il rene e crea un foro nella capsula renale.

Prendi un ago da impianto contenente tessuto di timo fetale umano e cellule derivate dal fegato fetale sospese in una miscela proteica gelatinosa.

Le cellule includono cellule staminali ematopoietiche ingegnerizzate, o HSC, che esprimono recettori chimerici dell'antigene, o CAR, mirati contro l'HIV.

Impiantare la sospensione cellulare e il tessuto del timo sotto la capsula, quindi chiudere l'incisione.

Successivamente, iniettare retro-orbitalmente le HSC che esprimono CAR e consentire al topo di riprendersi.

Nel rene, la miscela proteica gelatinosa polimerizza in una matrice, trattenendo le HSC nel sito di impianto.

Le HSC della matrice migrano verso il timo, differenziandosi in cellule T umane funzionali.

Nel frattempo, le HSC iniettate per via retroorbitale raggiungono il midollo osseo e si differenziano in cellule B umane funzionali, monociti e cellule NK.

Il modello murino con un sistema immunitario umano contro l'HIV è ora pronto.

Versare i pezzi di timo e il terreno dal pallone in un piatto da 60 millimetri. Raffreddare alcuni puntali per pipette a spostamento positivo inserendoli in provette sterili aperte da 1,5 millilitri con tappo a vite su ghiaccio. Inoltre, posizionare i pellet cellulari e un volume di miscela proteica gelatinosa, come Matrigel, sul ghiaccio.

Anestetizzare i topi riceventi con un anestetico iniettabile secondo un protocollo animale approvato. Controlla il livello di anestesia del topo stringendo una zampa. L'assenza di una reazione al pizzico indica un piano chirurgico di anestesia.

Radere il lato sinistro di ciascun topo dall'anca alla spalla, tra il centro della schiena e lo stomaco. Per via sottocutanea, iniettare 6 milligrammi per chilogrammo di carprofene diluito nella spalla o nel triangolo inguinale dell'animale. Lavare la cannula del trocar con PBS in un piatto da 60 millimetri. Usando un paio di pinze smussate e curve, posiziona un pezzo di timo dal piatto da 60 millimetri appena all'interno dell'apertura della cannula, quindi tira indietro il trocar per aspirare il tessuto nella cannula.

Quindi, utilizzare una pipetta a spostamento positivo e un puntale freddo per aggiungere 5 microlitri di miscela proteica gelatinosa fredda nella provetta con il pellet cellulare e mescolare delicatamente per generare la sospensione cellulare. Pipettare la sospensione cellulare nell'apertura della cannula e tirare lentamente indietro il trocar per caricare l'ago.

Tamponare l'area rasata del topo con iodio povidone seguito da isopropanolo tre volte. Determina la macchia più scura sotto la pelle, che indica la posizione della milza. Il rene è di circa 5 millimetri dorsale alla milza.

Dopo aver assicurato un livello adeguato di anestesia grazie all'assenza di una reazione al pizzico della zampa, utilizzare una pinza curva per sollevare la pelle e utilizzare le forbici chirurgiche per praticare un'incisione di 15 millimetri nella pelle parallela alla milza. Quindi, fai un taglio simile nello strato del peritoneo sottostante.

Nei maschi il rene è facilmente visibile, quindi estruso semplicemente premendo sull'addome. Sostieni il rene con un emostatico o un paio di pinze smussate curve. Nelle femmine, le ovaie tendono a bloccare il rene da una facile estrazione. Usando un emostato, prelevare l'ovaio ed esporre con cura il rene.

Usa una pinza con punta ad ago per praticare un piccolo foro all'estremità posteriore della capsula renale. Far scorrere il trocar in questo foro e lungo il rene fino a quando l'apertura della cannula non è completamente coperta dalla capsula renale. Estrudere delicatamente il tessuto sotto la capsula renale ed estrarre il trocar. Usa una pinza curva per assicurarti che il pezzo di timo non fuoriesca con l'ago.

Quindi, solleva il peritoneo con la pinza e usa delicatamente l'emostatico per spingere il rene di nuovo in posizione. Legare un punto a doppio nodo con sutura chirurgica nel peritoneo. Inoltre, posiziona due clip automatiche clip avvolte per chiudere la pelle.

Ora, mescola le cellule CD34-positive trasdotte e aspira 0,5 x 10⁶ cellule in un volume di 100 microlitri in una siringa da insulina. Iniettare queste cellule nel topo attraverso l'iniezione di vena retro-orbitale.

Dopo l'iniezione, tamponare una piccola goccia di lubrificante oculare su ciascun occhio e adagiare il topo su un lato in una gabbia. Dopo aver impiantato tutti i topi, conferma che gli animali hanno ripreso conoscenza e sono deambulanti prima di riportarli nella stanza di stabulazione.