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Inizia con una coltura di cellule staminali del midollo osseo.
Introdurre il tampone tripsina-EDTA per staccare le cellule e rompere i grumi cellulari, formando una sospensione a cellula singola.
Centrifugare, quindi rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con un mezzo nuovo.
Trasferire la sospensione in una siringa e collegarla a un'unità filtrante a membrana.
Spingere lo stantuffo ed eliminare il mezzo contenente filtrato.
Staccare il filtro. Riempia la siringa con un terreno fresco. Ricollegare il filtro e spingere rapidamente lo stantuffo.
La pressione del liquido spinge la cella verso i pori del filtro.
Questo produce una vescicola sferica della membrana plasmatica o PMV.
Queste vescicole contengono componenti cellulari e organelli circondati dalla membrana.
Esaminare il filtrato al microscopio a contrasto di fase invertito per osservare le vescicole sferiche traslucide.
Le dimensioni delle vescicole corrispondono alla dimensione dei pori della membrana filtrante, confermando la generazione di PMV.
Per generare le PMV, in primo luogo, le PMSC di topo di coltura in terreno di coltura DMEM completo in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule hanno raggiunto il 90% di confluenza, sciacquare il pozzetto con 0,5 millilitri di PBS privo di calcio e staccare le cellule con 0,5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25%.
Dopo tre minuti a 37 gradi Celsius, picchiettare la piastra con il palmo della mano alcune volte per facilitare la dissociazione cellulare e fermare la digestione con 1 millilitro di terreno di coltura. Trasferire le cellule in una provetta conica da 5 millilitri per la centrifugazione e risospendere il pellet in 4 millilitri di terreno di coltura fresco. Quindi, dividere le cellule tra due pozzetti di una nuova piastra a sei pozzetti e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 24 ore.
Il giorno successivo, raccogliere le cellule da un pozzetto mediante digestione della tripsina, come appena dimostrato, risospendendo il pellet in 0,5 millilitri di terreno di coltura fresco dopo la raccolta mediante centrifugazione. Caricare le cellule in una siringa da insulina da 1 millilitro e collegare la siringa a un'unità filtro. Premere rapidamente lo stantuffo per spremere le celle attraverso il filtro ed eliminare il mezzo estruso. Quindi, caricare ed erogare 0,5 millilitri di terreno di coltura extra attraverso il filtro, come appena dimostrato, raccogliendo il terreno dalla seconda estrusione.
Seminare 150 microlitri del terreno raccolto in un piatto con fondo di vetro da 35 millilitri e lasciare riposare le vescicole per circa 10 minuti. Quindi, confermare la presenza di PMV sotto un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una telecamera CCD che utilizza un obiettivo 20x.