Somministrazione orale di cellule di lievito trasformate nel sistema immunitario intestinale del topo

Iniziare con una provetta orale contenente una sospensione di lievito auxotrofico geneticamente trasformato che non è in grado di produrre nucleobasi uracile.

Inserire il tubo orale nella bocca di un topo trattenuto e guidarlo verso lo stomaco.

Somministrare la sospensione di lievito direttamente nello stomaco, permettendole di raggiungere l'intestino tenue.

L'intestino tenue contiene cellule epiteliali, con sottostanti chiazze di Peyer ricche di cellule immunitarie.

Le cellule microfold, cellule epiteliali intestinali specializzate vicino alle chiazze di Peyer, inghiottono le cellule di lievito e le internalizzano in vescicole.

Queste vescicole si muovono attraverso le cellule e rilasciano cellule di lievito nella zona di Peyer sottostante.

Isolare il cerotto di Peyer dall'intestino di topo sacrificato e ottenere una sospensione cellulare uniforme.

Coltivare questa sospensione cellulare su un terreno selettivo per il lievito contenente uracile.

Il lievito auxotrofico utilizza l'uracile e si moltiplica per formare colonie, confermando la consegna di cellule di lievito trasformate nel sistema immunitario intestinale del topo.

Dopo aver preparato le colture di lievito secondo il protocollo di testo, utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione cellulare e regolare da 10 al nono cellulare per millilitro. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 2.500 volte g per tre minuti. Quindi, versare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo il volume appropriato di acqua sterile e pipettando delicatamente su e giù.

Fissare un ago per sonda sonda su una siringa sterile da 1 millilitro e caricare il campione di lievito, eliminando eventuali bolle d'aria. Caricare una siringa aggiuntiva con acqua sterile per mettere la sonda ai topi di controllo. Usando la mano non dominante, prendi il mouse da afferrare e, con l'indice e il pollice, afferra saldamente la pelle intorno al collo. Infila la coda sotto il mignolo. Assicurati che l'impugnatura sia sicura e impedisca al mouse di muovere la testa.

Quindi, inserire delicatamente l'ago della sonda nell'esofago del topo inclinando l'ago lungo il palato e la parte posteriore della gola, mantenendolo leggermente a sinistra del centro. Attendi che il topo ingoi il bulbo dell'ago. Se si avverte resistenza o il topo ansima, rimuovere delicatamente l'ago e riprovare a trovare l'esofago.

Dopo che il topo ha ingerito il bulbo dell'ago gasato, premere delicatamente lo stantuffo della siringa per somministrare il lievito direttamente nello stomaco del topo. Rimuovere delicatamente l'ago della sonda gastrica dallo stomaco e dall'esofago del topo e rimettere il topo nella gabbia. Controllare che il topo respiri e si muova normalmente per assicurarsi che la sonda gastricata sia stata eseguita correttamente.

Dopo aver sacrificato il topo secondo il protocollo di testo, posizionarlo con l'addome completamente esposto e utilizzare etanolo al 70% per spruzzare la zona addominale. Con le forbici, praticare un'incisione trasversale attraverso il pelo e la pelle. Quindi, fai leva manualmente sull'incisione per esporre ulteriormente il peritoneo, il sottile rivestimento di sierosa che copre gli organi addominali. Sollevare delicatamente il peritoneo e praticare un'incisione trasversale per esporre l'intestino.

Quindi, usa una pinza smussata per allontanare con cura l'intestino tenue dalle arterie mesenteriche, dal grasso e da altri tessuti. Esporre l'intestino tenue dallo stomaco nel quadrante superiore sinistro dell'addome del topo al cieco, la grande tasca di tessuto intestinale all'inizio dell'intestino crasso.

Quindi, isola le chiazze di Peyer cercando chiazze di tessuto opaco da 1 a 2 millimetri di tessuto opaco lungo l'intestino tenue. Quindi, usando le forbici da dissezione curve, tagliare la cupola del cerotto di Peyer, lasciando margini per assicurarsi che non venga raccolto alcun tessuto circostante.

Trasferisci i cerotti di Peyer sezionati in IMDM completo. Quindi, versare la soluzione con i cerotti di Peyer sospesi su un colino cellulare da 40 micrometri. Dopo aver lavato i cerotti di Peyer con l'IMDM completo, utilizzare uno stantuffo da una siringa da 1 millilitro per rompere delicatamente il tessuto e raccogliere le cellule in una provetta da 50 millilitri. Pellettare le celle filtrate a 1.800 giri/min per sette minuti. Quindi attendi e analizza le celle secondo il protocollo di testo.