Generazione di neutrofili anti-angiogenici associati al tumore

Prendiamo un tumore del melanoma murino che comprende neutrofili associati al tumore, o TAN.

I TAN mostrano un'elevata attività dell'enzima nicotinamide fosforibosiltransferasi, o NAMPT, stimolando l'angiogenesi, la proliferazione dei vasi sanguigni nei tumori e facilitando la crescita tumorale.

Tritare il tessuto e aggiungere enzimi per degradare la matrice tissutale, allentando le cellule.

Filtrare la sospensione attraverso un colino e centrifugare per pellettare le cellule.

Aggiungere un tampone lisanti per lisare i globuli rossi, quindi centrifugare e scartare il surnatante contenente detriti cellulari.

Introdurre anticorpi per bloccare i recettori Fc cellulari, evitando così l'immunocolorazione non specifica.

Introdurre un cocktail di anticorpi marcati con fluorofori specifici per marcatori di superficie sui TAN e un colorante per discriminare le cellule morte.

Utilizzando il FACS, isolare i TAN vitali marcati con fluorofori e trasferirli su una micropiastra.

Aggiungere un inibitore che blocca l'attività NAMPT a pozzetti selezionati e incubare.

Utilizzare le cellule per valutare la loro capacità di stimolare l'angiogenesi. I TAN trattati con inibitori mostrano una ridotta angiogenesi rispetto ai TAN non trattati.

Per l'isolamento dei neutrofili associati al tumore, posizionare cinque tumori per pozzetto nei singoli pozzetti di una piastra sterile a sei pozzetti, man mano che vengono raccolti, e utilizzare forbici sterili per tritare i tumori in pezzi da 2 a 3 millimetri. Successivamente, digerire i frammenti tumorali con 1 millilitro di collagenasi a base di disco, soluzione di DNasi I per 45 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con umidità, mescolando i campioni con una siringa da 10 millilitri ogni 15 minuti.

Al termine dell'incubazione, filtrare le cellule attraverso filtri da 100 micrometri in una provetta da 15 millilitri per pozzetto per rimuovere le fibre non digerite e aggiungere PBS a un volume finale di 15 millilitri. Raccogliere le cellule dissociate mediante centrifugazione e lisare i globuli rossi con 1 millilitro di tampone di lisi per provetta.

Dopo la miscelazione, unire il contenuto di ciascuna provetta in un'unica provetta da 15 millilitri, interrompendo la reazione dopo due minuti con 11 millilitri di terreno completo a 4 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 1 millilitro di PBBS e bloccare qualsiasi legame aspecifico con tre microlitri di anticorpo bloccato FC per 15 minuti su ghiaccio.

Al termine dell'incubazione, marcare le cellule con anticorpi anti-CD11b e Ly6G e qualsiasi altro anticorpo di interesse più DAPI per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 14 millilitri di PBS e risospendere i pellet a una concentrazione di 1 x 10⁷ cellule per millilitro di terreno fresco completo su ghiaccio.

Quindi, selezionare i neutrofili CD11b-positivi Ly6G-high DAPI-negativi su un selezionatore cellulare attivato a fluorescenza secondo protocolli di selezione standard, controllando la purezza dei neutrofili isolati sul citometro a flusso alla fine della selezione. Per l'inibizione dei neutrofili associata a tumore in vitro, seminare 1,5 volte 10 al quinto separare i neutrofili in ciascuno dei due pozzetti di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti e aggiungere FK866 a una concentrazione finale di 100 nanomolari in terreno completo in un pozzetto e un volume uguale di terreno completo da solo nell'altro pozzetto. Dopo due ore nell'incubatore per colture cellulari, lavare le cellule due volte con PBS e risospendere i pellet in PBS alla concentrazione appropriata per la successiva iniezione.