JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
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Iniziare con una sospensione di Mycobacterium bovis BCG, trattata con un tensioattivo non ionico, per prevenire l'aggregazione batterica.
Quindi, aggiungere un reagente di biotinilazione e incubare.
Questo reagente di biotinilazione, un complesso di biotina complessato in un linker funzionale, facilita il legame delle molecole di biotina alle proteine di superficie batteriche, marcando i batteri.
Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione batterica marcata con biotina per rimuovere il reagente di biotinilazione non reagito.
Risospendere i batteri in un tampone. Aggiungere una soluzione di proteina di fusione dell'avidina, una proteina ricombinante che comprende un dominio antigenico bersaglio fuso con l'avidina monomerica.
Durante l'incubazione, l'avidina si lega alla biotina, facilitando la modifica della superficie batterica con antigeni bersaglio.
Centrifugare la sospensione per rimuovere le proteine di fusione non legate.
Risospendere i batteri rivestiti di antigene in un tampone contenente un tensioattivo non ionico. Il rivestimento dell'antigene sui batteri può migliorare la sua proprietà di innescare risposte immunitarie.
Lavora in una cabina di biosicurezza utilizzando dispositivi di protezione individuale perché il BCG è un agente patogeno di livello II.
Per biotinilare la superficie delle cellule BCG, per prima cosa, far crescere le cellule su una piattaforma shaker alla densità corretta. Raccogli circa 1 miliardo di cellule e lavale tre volte usando 500 microlitri di PBST ghiacciato senza endotossine. Quindi, fai girare le cellule e sospendile in PBS sterile privo di endotossine. Successivamente, preparare la biotina fresca Sulfo-NHS SS da 10 millimolari in acqua filtrata sterile. Quindi, incubare i batteri in 1 millilitro di brodo contenente 0,5 millimolari di biotina Sulfo-NHS SS. Eseguire l'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti.
Quindi, lavare i batteri ora etichettati tre volte con 500 microlitri di PBST ghiacciato, per rimuovere il reagente non reagito. Quindi, risospendere il pellet in 1 millilitro di PBST.
Miscelare 500 milioni di BCG biotinilati con la proteina di fusione avidina, per una concentrazione finale di 10 microgrammi di proteine per millilitro. Lasciate andare questa reazione per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker. Successivamente, lavare i batteri tre volte con 500 microlitri di PBST ghiacciato.