JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:16 min. • July 8th, 2025
Iniziare con una piastra a più pozzetti contenente una sospensione di cellule dendritiche o DC.
Per imitare una condizione ipertensiva, aggiungere un terreno di coltura contenente un'alta concentrazione di ioni sodio e incubare.
Durante l'incubazione, gli ioni sodio entrano nella cellula, aumentando la concentrazione intracellulare di sodio.
Questo innesca lo scambio di ioni sodio intracellulari con ioni calcio extracellulari.
L'aumento dei livelli interni di calcio attiva percorsi che facilitano la generazione di aldeidi reattive, che si legano alle proteine cellulari. Questo attiva le DC, che mostrano queste proteine modificate sulla loro superficie.
Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule in una provetta e centrifugare.
Rimuovere il surnatante. Aggiungere un nuovo tampone per risospendere le celle.
Aspirare la sospensione cellulare in una siringa.
Prendi un topo anestetizzato e inietta la sospensione cellulare per via retroorbitale, che è un'area dietro l'orbita.
Questo processo di iniezione di cellule immunitarie attivate è chiamato trasferimento cellulare adottivo.
Pipettare 900 microlitri di sospensione CC in una piastra Falcon a fondo piatto piatto a 24 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura DC ad alto contenuto di sale in ciascun pozzetto per una concentrazione finale di sodio di 190 millimolari. Etichettare la piastra e metterla in un incubatore di anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius per 48 ore.
Trascorse 48 ore, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Spazzare via i terreni di coltura cellulare in un singolo pozzetto su e giù per risospendere le DC CD11c-positive. Trasferire tutta la sospensione in una provetta da 1,6 millilitri etichettata corrispondente. Ripeti l'operazione per ogni singolo pozzetto che è stato placcato.
Centrifugare tutte le provette a 300 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet DC con 100 microlitri di DPBS sterile. Quindi, aspirare la soluzione CC da uno dei tubi in una siringa da 1 millilitro dotata di un ago da mezzo pollice calibro 27.
Posizionare l'ingenuo maschio di 10 settimane C57 black six mouse sotto il 2% di isoflurano per ottenere un piano chirurgico stabile. Controllare il livello di anestesia con la mancanza di riflesso del pedale. Una volta raggiunto un piano chirurgico stabile, introdurre lentamente e con attenzione l'ago nello spazio retroorbitale con un angolo di circa 30 gradi.
Lentamente e senza intoppi, iniettare la sospensione CC CD11c-positiva. Una volta completata l'iniezione, rimuovere con cautela l'ago per lo spazio retro-orbitale, facendo attenzione a non danneggiare l'occhio. Quindi, rimuovere i topi dal cono del naso e monitorarli per circa 30 minuti durante il recupero dall'anestesia.