Una tecnica per coltivare i neuroni dell'ippocampo del topo

Prendi un cucciolo di ippocampo di topo raccolto in un tampone.

Taglia l'ippocampo in frammenti più piccoli e trasferiscili in un tubo conico.

Lavare il fazzoletto con tampone. Una volta che i frammenti si sono depositati, rimuovere il tampone. Ora, aggiungi il tampone fresco e la tripsina.

Durante l'incubazione, la tripsina, un enzima proteolitico, digerisce la matrice extracellulare del tessuto, allentando i neuroni dell'ippocampo.

Lavare il fazzoletto digerito con un tampone.

Una volta che i frammenti si sono depositati, rimuovere il tampone. Aggiungere un tampone fresco e pipettare ripetutamente il tessuto per dissociarlo meccanicamente, ottenendo una sospensione unicellulare.

Una volta che il tessuto non digerito si è depositato, trasferire la sospensione cellulare su vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina con supporti in cera all'interno di una piastra di coltura contenente terreni.

Le cellule si attaccano alle superfici rivestite di poli-L-lisina attraverso interazioni elettrostatiche.

Ora, posiziona i vetrini coprioggetti aderenti ai neuroni rivolti verso il basso in un piatto contenente cellule corticali gliali o non neuronali in terreni privi di siero.

In coltura, i supporti in cera impediscono il contatto diretto tra neuroni e cellule gliali, creando un microambiente in cui i fattori secreti dalle cellule gliali promuovono la sopravvivenza e la maturazione neuronale.

Per iniziare, seziona da sei a otto ippocampi da cuccioli postnatali di un giorno con HBSS medium in una capsula di Petri. Tagliate gli ippocampi con le forbici da dissezione in pezzi più piccoli e trasferiteli dal piatto in un tubo da 15 millilitri. Lavare gli ippocampi due volte con 5 millilitri di HBSS e lasciarli in 4,5 millilitri di HBSS dopo il lavaggio.

Aggiungere 0,5 millilitri di tripsina al 2,5% in 4,5 millilitri di HBSS e incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti, capovolgendo la provetta ogni 5 minuti. L'ippocampo ben digerito dovrebbe diventare appiccicoso e formare un grappolo. Se necessario, prolungare la digestione per altri 5 minuti.

Lavare gli ippocampi con HBSS tre volte per 5 minuti per lavaggio. Dopo il lavaggio, aggiungere 2 millilitri di HBSS e pipettare l'ippocampo su e giù con una pipetta Pasteur 15 volte. Triturare il fazzoletto con una pipetta Pasteur lucidata a fuoco 10 volte e far riposare la provetta per cinque minuti fino a quando tutti i pezzi non si saranno fissati sul fondo. Ripeti la triturazione con i pezzi rimanenti fino a quando la maggior parte di essi non è scomparsa.

Quindi, utilizzare una punta per pipetta da 1 millilitro per trasferire delicatamente il surnatante contenente i neuroni dissociati nei piatti di impiattamento. Aggiungerlo direttamente al terreno di placcatura pre-incubato e agitare delicatamente la piastra. Da 2 a 4 ore dopo la semina, controllare le piastre di impiattamento con un microscopio ottico. La maggior parte dei neuroni dovrebbe essere attaccata al vetrino coprioggetti.

Utilizzando una pinza a punta fine, capovolgere i vetrini coprioggetti sui piatti di alimentazione delle cellule gliali contenenti terreno di coltura neuronale precondizionato con il lato del punto di cera rivolto verso il basso. I neuroni possono crescere nelle piastre di alimentazione delle cellule gliali per un massimo di un mese. Nutrire i neuroni ogni sette giorni con 1 millilitro di terreno di coltura neuronale fresco.