Generazione di una coltura di neuroni primari a bassa densità da neuroni embrionali congelati

Inizia con un crioviale contenente neuroni embrionali crioconservati e posizionalo in un blocco riscaldante per uno scongelamento controllato.

Successivamente, trasferire i neuroni scongelati in un tubo e diluirli con un mezzo neurobasale goccia a goccia per bilanciare la pressione osmotica e prevenire la lisi cellulare.

Questo genera una sospensione omogenea con neuroni uniformemente dispersi.

Seminare la sospensione neurale diluita su una piastra multipozzetto rivestita di poli-L-lisina contenente un mezzo neurobasale arricchito con sostanze nutritive e antibiotici.

Incubare per consentire alla poli-L-lisina caricata positivamente di interagire con i neuroni tramite interazioni elettrostatiche, facilitandone l'aderenza.

Fornire ai pozzetti terreni neurobasali freschi.

Incubare le cellule nello stesso terreno in condizioni di umidità per evitare l'evaporazione del terreno.

I neuroni embrionali utilizzano i nutrienti e crescono sviluppando processi neuronali e formando neuroni primari.

Il mezzo neurobasale mantiene i neuroni primari che appaiono ampiamente distanziati, generando una coltura primaria a bassa densità con connessioni neuronali.

Iniziare rivestendo una micropiastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di poli-L-lisina per pozzetto. Quindi, incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di poli-L-lisina. Lavare le piastre due volte con acqua sterilizzata e una volta con terreno di coltura fresco privo di integratori. Mettere i piatti ad asciugare. Le piastre asciutte possono essere avvolte e conservate fino a un mese a 4 gradi Celsius.

Per iniziare la semina cellulare, aggiungere 50 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto della piastra rivestita. Riempire i pozzetti periferici con 200 microlitri di acqua sterilizzata e incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.

Rimuovere il crioviale del neurone dal serbatoio dell'azoto liquido e posizionarlo in un blocco termico a 37 gradi Celsius per scongelarne parzialmente il contenuto. Utilizzando una pipetta da 1 millilitro con punta a foro largo, trasferire lentamente il contenuto della fiala goccia a goccia in una provetta sterile da 50 millilitri. Sciacquare il crioviale vuoto con 1 millilitro di terreno di coltura a temperatura ambiente. Trasferire la soluzione di risciacquo nel tubo da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare.

Quindi, aggiungere 9 millilitri di terreno di coltura a temperatura ambiente goccia per goccia nella provetta da 50 millilitri, portando il volume a 11 millilitri. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio. Ora, utilizzando una pipetta multicanale con puntali a foro largo, erogare la sospensione cellulare con un conteggio finale di 1,0 x 10⁴ cellule per pozzetto nella piastra rivestita a 96 pozzetti.

Incubare i neuroni per 1 o 2 ore a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Quindi sostituire il terreno di coltura con 100 microlitri di terreno di coltura preriscaldato e incubare nuovamente alle stesse condizioni.