Coltura di neuroni eccitatori fluorescenti da un cervello di cucciolo di topo transgenico

Prendi un cervello di cucciolo di topo transgenico.

Rimuovi il cervelletto e seziona il cervello. Separare il tessuto cortico-ippocampale contenente neuroni eccitatori che esprimono proteine fluorescenti.

Trasferire il tessuto in una piastra di coltura contenente tampone.

Tritare il fazzoletto e trasferirlo in un tubo contenente papaina.

La papaina digerisce la matrice extracellulare del tessuto, allentando le cellule, compresi i neuroni.

Trasferire il tessuto digerito in una provetta con proteine BSA, arrestando l'attività enzimatica e prevenendo il danno cellulare.

Dissociare meccanicamente i tessuti, rilasciando le cellule.

Centrifugare e rimuovere il surnatante contenente detriti ed enzimi.

Risospendere le cellule in mezzi neuronali a bassa fluorescenza e filtrarle attraverso un colino cellulare, rimuovendo gli aggregati cellulari.

Eseguire lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per identificare e ordinare i neuroni fluorescenti.

Trasferire i neuroni ordinati in una provetta da microcentrifuga e centrifugare. Risospendere i neuroni nei mezzi neuronali.

Neuroni seme su vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina in una piastra a più pozzetti. I neuroni aderiscono alle superfici rivestite.

Aggiungere i mezzi neuronali. Incubare per facilitare la crescita neuronale.

Per prima cosa, seziona il cervelletto e separa i due emisferi. Quindi, separa attentamente l'ippocampo e la corteccia da ciascun emisfero. Trasferire il tessuto sezionato in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente un tampone di coltura cellulare refrigerato.

Quindi, trasferisci l'ippocampo e la corteccia sezionati sul coperchio di un'altra capsula di Petri da 35 millimetri. Usando il bordo piatto della lama di un bisturi, taglia con cura il tessuto con un movimento incrociato fino a quando rimangono solo piccoli pezzi.

Quindi, trasferire il fazzoletto tritato con una piccola quantità di soluzione di papaina dal coperchio della capsula di Petri alla provetta sterile di papaina. Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per 25 minuti. Dopo l'incubazione della papaina, trasferire la provetta sterile di papaina e le provette sterili BSA nella camera di flusso. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur da 1 millilitro per trasferire solo il tessuto cortico-ippocampale dalla provetta di papaina alla provetta BSA 1.

Per rompere eventuali grumi di tessuto di grandi dimensioni, triturare il tessuto più volte utilizzando una pipetta Pasteur da 1 millilitro. Successivamente, triturare il tessuto sette volte utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine. Dopo 30 secondi, trasferire 1 millilitro della soluzione inferiore e del tessuto dalla provetta BSA 1 alla provetta BSA 2.

Triturare più volte il tessuto nella provetta BSA 2 utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine. Dopo la triturazione, trasferire 1 millilitro di tessuto inferiore in soluzione dalla provetta BSA 1 alla provetta BSA 3. Triturare più volte il tessuto nella provetta BSA 3.

Dopo la triturazione, trasferire tutta la soluzione e il tessuto dalle provette 2 e 3 nella provetta BSA 1. Triturare altre 2 o 3 volte e centrifugare a 3.000 volte g per 3 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante dal tessuto pellettato e risospendere le cellule utilizzando una pipetta P1000 in 2 millilitri di terreno completo Hibernate A a bassa fluorescenza. Quindi, triturare il tessuto 20 volte per garantire la completa risospensione della soluzione tissutale.

Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un setaccio cellulare da 30 micrometri in una provetta per campioni di polistirene. Preparare le provette di raccolta per la selezione cellulare pipettando 300 microlitri di terreno di ibernazione A completo fino al numero richiesto di provette in polipropilene.

Per ogni tipo di cella fluorescente da ordinare, scegliere i filtri di eccitazione ed emissione appropriati. Eccita la proteina venosa utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e rileva la luce emessa attraverso un set di filtri di emissione 530 su 40.

Eccita la proteina TdTomato utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 531 nanometri e rileva la luce emessa attraverso un set di filtri di emissione 575 su 30. Per un'elevata purezza, selezionare le celle fluorescenti con etichetta brillante. Dopo lo smistamento delle cellule, trasferire le cellule raccolte in provette da centrifuga a fondo tondo da 2 millilitri. Quindi, centrifugare le celle a 3.000 volte g per 3 minuti per formare un pellet di cellule.

Risospendere il pellet di cella nella quantità richiesta di terreno NBA completo preriscaldato per ottenere una densità cellulare di 1.000 celle per microlitro. Per confermare la presenza di cellule dissociate, controllare la soluzione cellulare al microscopio utilizzando un obiettivo 4x o 10x. Prima di placcare le celle, agitare a velocità media per 2 o 3 secondi per garantire una sospensione uniforme delle celle.

Dopo il vortice, pipettare rapidamente 10 microlitri della sospensione cellulare al centro di ciascun vetrino coprioggetti. Dopo un'ora, alimentare le cellule con 500 microlitri di terreno NBA completo preriscaldato e rimetterle nell'incubatore a 37 gradi Celsius.