JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:51 min • July 8th, 2025
Inizia con una piastra a più pozzetti contenente un inserto poroso che sostiene un'impalcatura in polistirene dotata di una struttura porosa tridimensionale.
Aggiungere etanolo per reidratare l'impalcatura e lavarla con il substrato.
Introdurre un terreno contenente una proteina della matrice extracellulare, la laminina. Incubare per consentire alla laminina di rivestire l'impalcatura.
Semina le cellule staminali neurali umane in un mezzo neurale contenente fattori di crescita sull'impalcatura rivestita di laminina.
Incubare per consentire la migrazione delle cellule staminali nell'impalcatura porosa dove la laminina promuove l'adesione cellulare all'impalcatura.
Le cellule utilizzano i fattori di crescita e proliferano all'interno di questa impalcatura.
Aggiungi un mezzo neurale privo di fattore di crescita e sostituisci regolarmente il terreno esaurito per mantenere la vitalità cellulare.
L'assenza di fattori di crescita stimola la differenziazione delle cellule staminali in cellule progenitrici neurali.
Nel tempo, i processi neurali di queste cellule progenitrici si allungano, consentendo la crescita cellulare multidirezionale e formando una coltura tridimensionale.
Reidratare gli scaffold aggiungendo a ciascun pozzetto della piastra Alvetex a 12 pozzetti, 2 millilitri di etanolo al 70%, preparati utilizzando acqua per l'irrigazione. Evitare di toccare le impalcature erogando il 70% di etanolo lungo la parete di ciascun pozzetto. Aspirare con cura l'etanolo al 70% e lavare immediatamente gli scaffold con 2 millilitri per pozzetto di DMEM F12 per un minuto.
Ripetere la procedura di lavaggio due volte. Aspirare con cura il DMEM F12 dopo il lavaggio finale. Rivestire gli scaffold aggiungendo 2 millilitri di laminina in DMEM F12 a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per un minimo di due ore.
Successivamente, lavare la piastra con DMEM F12 caldo. Semina ogni impalcatura con circa 500.000 cellule staminali neurali umane o HNSC in un volume di 150 microlitri di terreno RMM con fattori di crescita. Incubare la piastra per tre ore per consentire alle cellule di depositarsi negli scaffold.
Dopo tre ore, aggiungere 3,5 millilitri di RMM a ciascun pozzetto, facendo attenzione a non staccare le cellule dagli scaffold. Incubare la piastra per sette o 21 giorni. Sostituire il terreno dopo un giorno, che è la prima poppata, e sostituire nuovamente il terreno 2 o 3 giorni dopo la prima poppata.