Generazione di neuroni simpatici postgangliari da cellule staminali pluripotenti umane

Prendere una micropiastra rivestita di matrice extracellulare e aggiungere cellule staminali pluripotenti umane sospese in un mezzo di differenziazione.

Il mezzo contiene molecole di segnalazione che influenzano le vie di segnalazione cellulare, dirigendo la differenziazione nelle cellule progenitrici neurali.

Introdurre un altro mezzo di differenziazione contenente molecole di segnalazione che inducono la differenziazione in cellule della cresta neurale, o NCC, precursori delle cellule neuronali e non neuronali.

Aggiungere enzimi per interrompere la matrice, dissociando così le cellule.

Lavare per neutralizzare gli enzimi, quindi centrifugare e scartare il surnatante. Risospendere gli NCC in un mezzo sferoidale e trasferirli su una micropiastra.

I fattori di crescita del mezzo e le piccole molecole inducono la formazione di sferoidi.

Integrare con acido retinoico, che favorisce la differenziazione in neuroni progenitori simpatici.

Trasferire lo sferoide su una micropiastra rivestita di proteine di adesione in un mezzo di maturazione del neurone simpatico, provocando l'adesione dello sferoide.

I fattori di crescita neurali e l'acido retinoico nel mezzo promuovono la maturazione in neuroni simpatici postgangliari, che fanno parte del sistema nervoso periferico e regolano i processi involontari.

Un giorno prima dell'induzione della differenziazione, rivestire il numero appropriato di piastre a sei pozzetti con due millilitri di matrice della membrana basale per pozzetto e conservare le piastre a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, riscaldare le piastre a temperatura ambiente e lavare la coltura di cellule staminali pluripotenti umane pronte per la scissione due volte con PBS fresco per lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, trattare le cellule con sette millilitri di EDTA 0,5 millimolare per 15 minuti nell'incubatore di coltura cellulare, prima di aspirare le cellule staminali pluripotenti umane galleggianti e trasferire le cellule raccolte in una provetta da 50 millilitri.

Aggiungere un volume uguale di PBS alla provetta per diluire l'EDTA e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di differenziazione giorno 01. Prima di aggiungere un volume appropriato di terreno per il conteggio, diluire le cellule a una concentrazione di 1,25 x 10⁵ cellule per centimetro quadrato in due millilitri di terreno di differenziazione per pozzetto.

Aspirare tutta la soluzione della matrice della membrana basale da ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti precedentemente preparata. Quindi, seminare 2 millilitri di cellule in ciascun pozzetto e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. La mattina successiva, nutrire le cellule con 3 millilitri di terreno di differenziazione del giorno 01 per pozzetto.

Il secondo giorno di differenziazione, nutrire le cellule con tre millilitri di terreno di differenziazione dal secondo giorno a dieci per pozzetto. Quindi, nutri le cellule a giorni alterni fino al giorno 10. Per aggregare le cellule della cresta neurale in sferoidi, il giorno 10, lavare le cellule con PBS e aggiungere due millilitri di terreno di dissociazione a ciascun pozzetto. Dopo 20 minuti nell'incubatore per colture cellulari, trasferire le cellule galleggianti in una provetta conica da 50 millilitri e portare il volume di sospensione nella provetta a 50 millilitri con PBS fresco.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un volume sufficiente di terreno sferoidale al giorno 10-14 per il conteggio. Dopo il conteggio, diluire le cellule a una concentrazione di 5 x 10⁵ cellule per 500 microlitri utilizzando un terreno sferoidale dal giorno 10 al 14 e immergere 500 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti a bassissimo attacco. Quindi rimettere le cellule nell'incubatore per colture cellulari.

Per indurre una coltura sferoidale minima, l'11° giorno di coltura, nutrire gli sferoidi della cresta neurale con ulteriori 500 microlitri di terreno sferoidale al giorno 10-14 per pozzetto. Il giorno 12, inclinare la piastra per accumulare gli sferoidi su un lato della piastra e aspirare con cura quanto più terreno possibile da ciascun pozzetto senza aspirare gli sferoidi. Quindi, nutrire gli sferoidi con un millilitro di terreno sferoidale al giorno da 10 a 14 per pozzetto.

Per indurre una coltura sferoidale espansa il giorno 15, nutrire gli sferoidi con 1,5 millilitri di terreno sferoidale al giorno 10-14 integrati con acido retinoico 0,5 micromolare per pozzetto. Quindi, rimettere gli sferoidi nell'incubatore per colture cellulari.

Per la differenziazione dei neuroni simpatici il giorno 14 o 28, inclinare la piastra per accumulare gli sferoidi su un lato della piastra e aspirare con cura quanto più terreno possibile. Nutrire le cellule con un millilitro di terreno neuronale simpatico.

Per rompere i grandi aggregati di sferoidi in sferoidi più piccoli, aggiungere non più di un millilitro di terreno per pozzetto e pipettare gli sferoidi da cinque a 10 volte prima di dividerli.

E rimuovere l'eccesso di laminina, fibronectina dalle piastre a 24 pozzetti precedentemente preparate. Dividere la piastra di un millilitro di sferoidi da ciascun pozzetto sulla piastra di coltura sferoidale a 24 pozzetti tra quattro pozzetti separati della piastra a 24 pozzetti appena rivestita. Aggiungere 250 microlitri di terreno di coltura per neuroni simpatici freschi a ciascun pozzetto e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. La mattina successiva, sostituire il terreno in ciascun pozzetto con un millilitro di terreno per neuroni simpatici integrato con acido retinoico 0,125 micromolare e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo il giorno 35, nutrire i neuroni sostituendo con cura solo metà del terreno esistente in ogni pozzetto con terreno fresco.