Generazione e differenziazione di neurosfere primarie da cellule staminali neurali di pesce zebra

Iniziare con una piastra multipozzetto contenente un terreno di coltura arricchito con fattori di crescita.

Seminare una sospensione unicellulare di cellule staminali neurali di pesce zebra e incubare.

Inizialmente, le cellule staminali utilizzano i fattori di crescita e proliferano.

Rimuovere i detriti e aggiungere il terreno fresco per promuovere la proliferazione cellulare continua e l'aggregazione spontanea per formare neurosfere primarie fluttuanti.

Quindi, trasferisci le neurosfere in un pozzetto fresco contenente il terreno di coltura.

Incubare nelle stesse condizioni per indurre una progressiva espansione delle neurosfere.

Pipettare ripetutamente per dissociare meccanicamente le neurosfere in piccoli cluster.

Successivamente, trasferirli su una matrice extracellulare ben rivestita, facilitandone l'adesione.

Sostituire il terreno di coltura con un terreno di differenziazione privo di fattore di crescita contenente insulina.

L'assenza di fattori di crescita e la presenza di insulina stimolano la differenziazione cellulare in cellule gliali e neuroni con proiezioni neuronali.

Per prepararsi alla generazione della neurosfera, riempire ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti