Generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Prendiamo colonie di cellule staminali pluripotenti indotte, o iPSC, coltivate su una matrice di supporto.

Aggiungere una soluzione contenente enzimi per dissociare le colonie in singole cellule.

Trasferire le cellule in una provetta, centrifugarle e scartare il surnatante.

Risospendere le iPSC in un mezzo di crescita.

Trasferire le cellule in una micropiastra contenente fibre polimeriche biocompatibili.

Centrifuga per aggregare forzatamente le iPSC, formando corpi embrioidi, o EB, sullo scaffold polimerico.

Transizione a un mezzo di induzione neurale che promuove la proliferazione e la differenziazione delle iPSC in cellule staminali neurali, cellule progenitrici e neuroni immaturi.

Dopo l'incubazione, le cellule subiscono l'auto-organizzazione.

Posizionare i corpi embrioidi su un foglio increspato e aggiungere gocce contenenti proteine della matrice extracellulare.

Incubare per solidificare la matrice, incorporando gli EB.

Trasferire gli EB in una micropiastra contenente un mezzo di mantenimento neurale. Incubare.

Gli EB subiscono una proliferazione cellulare per formare sporgenze e gemmazioni e differenziarsi in neuroni maturi, formando organoidi cerebrali.

Aspirare il terreno con una pipetta e lavare le cellule una volta con DPBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione di distacco cellulare, o EDTA 0,5 millimolare, per dissociare le colonie e incubare a 37 gradi Celsius per 3-5 minuti. Quindi, aggiungere 1 millilitro di terreno E8 fresco a ciascun pozzetto e pipettare delicatamente per staccare tutte le cellule.

Trasferire l'intera sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millimetri e aggiungere un altro 1 millilitro di terreno E8 fresco. Quindi, centrifugare le celle a 290 g per 3 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 millilitro di terreno E6, integrato con 50 inibitori micromolari di ROCK, e contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Preparare una sospensione cellulare della densità di sede desiderata in terreno E6, integrata con l'inibitore ROCK. Quindi, aggiungere 150 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a 96 pozzetti.

Quindi, centrifugare la piastra a 290 g per 3 minuti a temperatura ambiente per forzare l'aggregazione delle cellule. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica per la formazione di corpi embrioidi.

Dopo 24 ore di incubazione, trasferire la piastra nella cappa e aspirare con cura 120 microlitri di terreno utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non aspirare il corpo embrioide abbassando troppo la punta della pipetta nel pozzetto.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri di terreno E6 fresco, integrato con 2 micromolari XAV939 e gli inibitori SMAD in ciascun pozzetto. Trasferire nuovamente la piastra nell'incubatrice e sostituire il terreno ogni giorno con E6 appena preparato, integrato con gli inibitori.

Al settimo giorno di incubazione, controllare se tutti i corpi embrioidi hanno raggiunto un diametro compreso tra 550 e 600 micrometri e mostrano un bordo liscio e chiaro. In questa fase, sono pronti per essere incorporati in una matrice extracellulare.

Per incorporare gli organoidi, preparare fogli di inclusione con fossette posizionando un foglio di pellicola sigillante termoplastica lungo 4 pollici su una scatola P200 vuota. Quindi utilizzare una provetta conica da 15 millilitri o una provetta da microcentrifuga da 500 microlitri e premere delicatamente il foglio di pellicola nei fori per ottenere 12 o il numero desiderato di fossette.

Successivamente, spruzzare etanolo al 70% sul foglio di pellicola e lasciarlo asciugare all'interno della cappa con la luce UV accesa per almeno 30 minuti. Nel frattempo, scongelare una quantità sufficiente di matrice della membrana basale sul ghiaccio. Quindi, utilizzando una punta P200 a foro largo, trasferire un corpo embrioide dalla piastra a 96 pozzetti a ciascuna fossetta. Rimuovere la maggior quantità possibile di terreno con un normale puntale per pipetta, ma non lasciare asciugare il corpo embrioide.

Successivamente, con una normale punta P200 pre-raffreddata, aggiungere circa 30 microlitri di matrice a membrana non diluita a ciascun organoide, assicurandosi che il corpo embrioide sia il più vicino possibile al centro della gocciolina.

Una volta che tutti i corpi embrioidi sono incorporati nella matrice, posizionare il foglio di pellicola in una capsula di Petri sterile. Quindi incubare la capsula di Petri a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica per consentire alla matrice della membrana di solidificarsi.

Per la differenziazione degli organoidi, aggiungere 5 millilitri del terreno di differenziazione preparato con B27 senza vitamina A a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso. Preriscaldare la piastra a 37 gradi Celsius in un'incubatrice. Una volta che la matrice di membrana si è solidificata, trasferire i corpi embrioidi incorporati nella piastra a 6 pozzetti spingendo fuori le fossette dal retro del foglio di pellicola. Se necessario, utilizzare 1 millilitro di terreno dal pozzetto e pipettarlo sul foglio per staccare le goccioline dal foglio di pellicola.