Costruzione di reti neuronali tridimensionali accoppiate a array di microelettrodi

Prendi una sospensione di neuroni ippocampali embrionali di ratto.

Trasferisci i neuroni sull'area attiva rivestita di fattore di adesione di un array di microelettrodi, o MEA. Questa area attiva è delimitata da una struttura polimerica.

Incubare il MEA. I neuroni aderiscono all'area attiva MEA rivestita, formando una rete neuronale 2D.

Inoltre, trasferire i neuroni su un monostrato di microsfere di vetro rivestito con fattore di adesione in inserti di membrana all'interno di una piastra a più pozzetti.

Incubare per far sì che i neuroni si attacchino alle perle rivestite di fattore di adesione.

Trasferire le microsfere con i neuroni aderenti nell'area MEA confinata contenente la rete neuronale.

Le microsfere si autoassemblano per formare una struttura esagonale.

Ripetere più volte il trasferimento di microsfere sul MEA, costruendo strati che si autoassemblano, formando una struttura 3D compatta.

Aggiungere il terreno all'area attiva confinata MEA e incubare.

I neuroni crescono, formando una rete neuronale 3D interconnessa.

Piastra le cellule a una densità di 2.000 cellule per millimetro quadrato sull'area attiva del MEA, definita dal vincolo PDMS per creare una rete neuronale 2D. Quindi, posizionare il dispositivo MEA nell'incubatrice con un'atmosfera di anidride carbonica umidificata al 5% a 37 gradi Celsius.

Per completare la fase preliminare per la costruzione della coltura 3D, distribuire 160 microlitri di sospensione con una concentrazione cellulare da 600 a 700 cellule per microlitro sulla superficie del monostrato di microsfere posizionato all'interno delle piastre multipozzetto. Quindi, posizionare le piastre multipozzetto nell'incubatore con un'atmosfera di anidride carbonica umidificata al 5% a 37 gradi Celsius.

Da sei a otto ore dopo la placcatura, trasferire da 30 a 40 microlitri di sospensione con microsfere e neuroni nell'area della MEA delimitata dal vincolo PDMS. Dopo ogni trasferimento, attendere circa mezzo minuto per consentire alle microsfere di autoassemblarsi in una struttura compatta esagonale. Una volta che tutti gli strati sono stati depositati e assemblati spontaneamente, aggiungere 300 microlitri di terreno sulla parte superiore dell'area delimitata dal vincolo PDMS.

Mettere la struttura 3D accoppiata al MEA nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 48 ore.