JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:53 min. • July 8th, 2025
Iniziare con una piastra a più pozzetti contenente un inserto a membrana permeabile rivestito con poli-D-lisina.
Aggiungere il terreno di coltura degli astrociti al pozzetto e seminare gli astrociti, una cellula gliale specializzata, nell'inserto.
Incubare per consentire l'adesione cellulare sulla poli-D-lisina tramite interazioni elettrostatiche e formare un monostrato.
Sostituire il terreno degli astrociti con un terreno di coltura neuronale.
Trasferire questo inserto in una piastra multipozzetto contenente neuroni embrionali primari di topo aderenti su un vetrino coprioggetti rivestito di polimero.
Incubare per stabilire una co-coltura indiretta neurone-astrocita, in cui i due tipi di cellule sono fisicamente separati ma condividono lo stesso terreno di coltura.
Gli astrociti secernono vari fattori neurotrofici essenziali per la sopravvivenza e la crescita dei neuroni.
Questi fattori migrano attraverso il supporto permeabile e interagiscono con i neuroni primari. Questo favorisce la loro differenziazione e forma proiezioni neuronali.
Queste proiezioni si allungano e stabiliscono connessioni sinaptiche tra i neuroni, indicando interazioni neurone-glia.
Rivestire ogni inserto con 10 microgrammi per millilitro di poli-D-lisina e incubare per un'ora. Dopo un'ora, lavare gli inserti due volte con PBS.
Nel frattempo, aspirare il terreno degli astrociti e lavare la coltura una volta con 10 millilitri di PBS per assicurarsi che il siero residuo venga rimosso. Successivamente, aggiungere 3 millilitri di tripsina EDTA allo 0,05% ai palloni e incubare le cellule per la tripsinizzazione per circa 10 minuti. Successivamente, risospendere delicatamente le cellule in 7 millilitri di terreno astrocitario.
Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 216 volte g. Quindi, aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 millilitro di terreno astrocitario. Contare le celle utilizzando una camera di conteggio. Successivamente, riempire la piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di terreno astrocitario per pozzetto. Aspirare il PBS e trasferire 25.000 cellule in 500 microlitri di terreno astrocitario in ogni singolo inserto e incubare la coltura a 37 gradi Celsius.
Per sezionare l'ippocampo, preparare tre piatti da 10 centimetri riempiti con terreno di preparazione e un tubo da 2 millilitri con 1 millilitro di terreno di preparazione. Sezionare gli ippocampi dalle frazioni della corteccia e raccoglierli in un tubo da 2 millilitri riempito con terreno di preparazione.
È fondamentale che l'ippocampo sia isolato senza alcun tessuto adiacente proveniente da altre regioni del SNC. Pertanto, dopo aver rimosso l'ippocampo, i tessuti contaminanti estranei devono essere ulteriormente rimossi.
Dopo la dissezione, trasferire la provetta su un banco sterile a flusso laminare. Rimuovere con cura il terreno di preparazione e digerire il tessuto ippocampale con 1 millilitro di soluzione digestiva contenente papaina. Dopo 15 minuti di digestione, prelevare con cautela la soluzione digestiva aspirando delicatamente con una pipetta.
A causa dell'elevata sensibilità del neurone, è fondamentale triturare attentamente l'ippocampo per evitare bolle e ottenere l'intensità di triturazione ottimale.
Lavare l'ippocampo tre volte con terreno neuronale aggiungendo e aspirando con cura 1 millilitro di terreno di coltura fresco per ciclo di lavaggio. Dopo l'ultima fase di lavaggio, triturare accuratamente il tessuto in 1 millilitro di terreno neuronale. Quindi, contare le cellule utilizzando una camera di conteggio. Piastra 35.000 cellule in 500 microlitri di terreno neuronale per pozzetto della piastra a 24 pozzetti e incuba i neuroni a 37 gradi Celsius per un'ora.
Ora, estrarre dall'incubatrice gli inserti preparati, che sono stati seminati con monostrati di astrociti confluenti. Sostituire il terreno aspirando il terreno degli astrociti e sostituendolo con 500 microlitri di terreno neuronale fresco.
Quindi, posizionare con cura gli inserti con gli astrociti nei pozzetti che contengono le colture neuronali utilizzando una pinza sterile. Successivamente, riposizionare la co-coltura di astrociti con neuroni indiretti risultante nell'incubatrice fino agli esperimenti.