Una tecnica semplice per isolare e coltivare gli astrociti murini

Tagliare la corteccia di un topo in piccoli pezzi e trasferirla in un mezzo di dissezione freddo contenente una soluzione salina tamponata.

Aggiungere enzimi digestivi per dissociare la matrice extracellulare.

Per rimuovere gli enzimi residui, lavare con il mezzo di dissezione freddo.

Sostituisci questo terreno con un mezzo di arricchimento degli astrociti.

Quindi, utilizzare una pipetta per dissociare i pezzi di tessuto.

Passare la sospensione attraverso un colino per rimuovere il tessuto indissociato e ottenere singole cellule.

Trasferire le celle su una piastra rivestita di polimero caricata positivamente. Incubare agitandosi.

Gli astrociti aderiscono saldamente, mentre i neuroni debolmente legati, la microglia e gli oligodendrociti si staccano.

Il mezzo di arricchimento converte gli astrociti maturi in astrociti poligonali in divisione.

Rimuovere le cellule staccate e lavare gli astrociti con un tampone fosfato.

Aggiungi enzimi digestivi per staccare gli astrociti.

Aggiungere un terreno contenente siero per fermare l'attività enzimatica. Raccogliere gli astrociti in una provetta e centrifugare.

Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in un mezzo di maturazione degli astrociti per promuovere una tipica struttura di astrociti maturi a forma di stella.

Tagliare qualsiasi tessuto corticale da utilizzare per generare astrociti in pezzi non più grandi di 1 millimetro cubo. Una volta raccolti tutti i pezzi di tessuto, attendere che si depositino sul fondo del tubo. Quindi, aspirare quanto più terreno possibile. Successivamente, aggiungere da 2 a 3 millilitri di tripsina EDTA allo 0,05% e incubare i campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, aspirare con cura la tripsina EDTA, lasciando pezzi di tessuto in una quantità minima di liquido sul fondo della provetta. Quindi, aggiungere 5 millilitri di terreno di dissezione preraffreddato per lavare via la tripsina EDTA rimanente e pipettare sul lato del tubo superiore per ottenere la miscelazione dei pezzi di tessuto. Quindi aspirare il mezzo di dissezione e lasciare i pezzi di tessuto nel minor liquido possibile.

Ripetere questa fase di lavaggio con il mezzo di dissezione preraffreddato due volte. Dopo l'ultima fase di lavaggio, aggiungere 1 millilitro di DMEM PLUS a temperatura ambiente e titolare il tessuto pipettandolo su e giù senza introdurre bolle.

Gli astrociti sono abbastanza sensibili al pH, quindi è importante evitare di produrre bolle in quanto ciò potrebbe modificare il pH della soluzione.

Quindi, posizionare un filtro cellulare da 100 micron nell'apertura di un tubo da 50 millilitri e pre-bagnare il filtro con 4,5 millilitri di DMEM PLUS preraffreddato. Pipettare 1 millilitro di sospensione tissutale dissociata sul filtro cellulare e aggiungere altri 4,5 millilitri di DMEM PLUS preraffreddato per lavare le cellule attraverso di esso. Il giorno in vitro 7 dopo la dissezione, posizionare le piastre da 10 centimetri con le cellule in DMEM PLUS su uno shaker nell'incubatore e agitare le piastre a 110 giri/min per sei ore.

Da 20 a 30 minuti prima della fine delle sei ore di agitazione, preriscaldare 1X PBS, DMEM PLUS, NB+H e 0,25% di tripsina EDTA a 37 gradi a bagnomaria. Dopo sei ore di agitazione, togliere i piatti di coltura dall'agitatore e sostituire immediatamente il terreno con 10 millilitri di 1X PBS preriscaldato per piatto. Successivamente, rimuovere il PBS e aggiungere 3 millilitri di tripsina EDTA preriscaldata per piatto.

Quindi, incubare i campioni per quattro minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungi 5 millilitri di DMEM PLUS preriscaldato a 3 millilitri di tripsina EDTA in ogni piatto. Pipettare le cellule dal piatto e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 millilitri. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 3.220 volte g a 20 gradi Celsius per quattro minuti. Quindi rimuovere il surnatante, quindi risospendere il pellet cellulare in 1 millilitro di NB+H preriscaldato.