Sviluppo di una cocoltura di neuroni e macrofagi in vitro

Inizia con i neuroni del ganglio della radice dorsale murina isolati in un mezzo di crescita.

Seminali su una piastra multipozzetto rivestita di polimero per favorire l'adesione neuronale.

Quindi, prendi un topo sezionato eutanasia e inietta PBS ghiacciato nella sua cavità peritoneale.

Massaggiare delicatamente il peritoneo per rimuovere i macrofagi dalla parete del peritoneo.

Spremere il topo per raccogliere il liquido peritoneale e trattarlo con un tampone di lisi per lisare selettivamente i globuli rossi, che appaiono come contaminanti. Centrifugare e risospendere le cellule in un terreno di coltura.

Trasferire i macrofagi in un inserto poroso posizionato all'interno del pozzetto contenente i neuroni in coltura.

Questa co-coltura consente ai neuroni e ai macrofagi di essere in stretta vicinanza.

Trattare la co-coltura con db-cAMP e incubare per facilitarne l'ingresso nelle cellule. Questo attiva i neuroni per secernere le molecole di segnalazione.

Queste molecole di segnalazione, insieme al db-cAMP, inducono i macrofagi ad adottare un fenotipo pro-rigenerativo e secernono fattori essenziali per la crescita neuronale.

Prima di impostare la coltura, rivestire una piastra a 6 pozzetti con poli-D-lisina e laminina. Quindi, incubare la piastra a 6 pozzetti con 0,01 poli-D-lisina a 37 gradi Celsius per due ore o a 4 gradi Celsius durante la notte. Successivamente, lavare il piatto due volte con acqua distillata.

Quindi, incubare la piastra con una soluzione di laminina a una concentrazione di 3 microgrammi per millilitro per due ore a temperatura ambiente. Successivamente, lavare la piastra due volte con acqua distillata e asciugare la piastra a temperatura ambiente per almeno un'ora.

Ora, incidi la pelle sovrastante la colonna vertebrale di un topo eutanasia con una lama chirurgica e seziona bilateralmente i muscoli paravertebrali per esporre le ossa vertebrali. Rimuovere meticolosamente le ossa vertebrali utilizzando una rondure chirurgica a punta stretta fino a quando i DRG non sono completamente esposti.

Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere il DRG bilateralmente da S1 fino al livello C1 utilizzando le forbici per iridectomia e le pinze a punta fine. Trasferire il DRG in una provetta Eppendorf da 1,5 millilitri utilizzando un puntale per pipetta blu con un'estremità tagliata.

Quindi, rimuovere il DMEM dopo una rapida centrifuga per alcuni secondi utilizzando una mini-centrifuga. Aggiungere 1 millilitro di DMEM contenente 125 unità per millilitro di collagenasi di tipo 11 e incubare la provetta per 90 minuti con una leggera rotazione utilizzando una torsione o uno shaker a 37 gradi Celsius.

Successivamente, scartare il DMEM contenente collagenasi e aggiungere 1 millilitro di DMEM fresco. Trasferire il DRG in una provetta conica da 15 millilitri utilizzando un puntale per pipetta blu con un'estremità tagliata. Quindi, pipettare delicatamente su e giù, almeno 15 volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea.

Centrifugare la provetta a 239 g per tre minuti e scartare con cura il surnatante con detriti galleggianti. Aggiungere 1 millilitro di terreno neurobasale integrato con B27 e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente su e giù da cinque a 10 volte.

Successivamente, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri sovrapposto a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi, piastra tutti i neuroni DRG raccolti su due pozzetti della piastra a 6 pozzetti.

Per preparare i macrofagi peritoneali primari da un topo adulto, incidere delicatamente la pelle addominale per esporre il peritoneo ed evitare di tagliare il peritoneo per evitare la fuoriuscita di liquido di lavaggio.

Successivamente, perforare il peritoneo utilizzando una siringa con un ago calibro 22 e iniettare 10 millilitri di PBS ghiacciato nella cavità peritoneale. Massaggiare delicatamente il peritoneo per uno o due minuti. Quindi, estrarre l'ago e spremere il PBS attraverso il sito di puntura dell'ago e raccogliere il liquido di lavaggio in un tubo conico da 50 millilitri.

Successivamente, centrifugare il liquido di lavaggio a 239 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius per pellettare i componenti cellulari. Successivamente, risospendere il pellet con 3 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per tre minuti a temperatura ambiente.

Quindi, centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 239 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Risospendere le cellule pellettate in 1 millilitro di terreno neurobasale B27. Piastra metà di tutti i macrofagi raccolti su un inserto di coltura cellulare con un'area effettiva di 4,2 centimetri quadrati, che viene posizionato sopra il pozzetto di DRG dissociato.

Quattro ore dopo che i macrofagi neuronali sono stati co-coltivati, aggiungere 2 microlitri di soluzione di AMP ciclico db da 100 micromolari alle co-colture di macrofagi neuronali. Dopo 24 ore, riempire un pozzetto vuoto con 1 millilitro di terreno di coltura per macrofagi nella stessa piastra a 6 pozzetti.

Trasferire l'inserto di coltura cellulare nella co-coltura di macrofagi neuronali nel pozzetto vuoto con terreno di coltura per macrofagi.