Monitoraggio del trasporto assonale degli organelli nei motoneuroni utilizzando un dispositivo microfluidico

Inizia con una camera microfluidica rivestita di polimero con pozzetti prossimali e distali collegati tramite più microscanalature.

Nel pozzetto prossimale, posizionare i tessuti embrionali del midollo spinale di topo ricchi di motoneuroni in via di sviluppo.

Integra bene questo con un mezzo nutritivo. Incubare per consentire la crescita dei neuroni e l'aderenza alla superficie rivestita di polimero.

Successivamente, aggiungi un mezzo nutritivo privo di fattore di crescita al pozzetto prossimale.

Nei pozzetti distali, aggiungere un volume maggiore di terreno nutritivo contenente fattori di crescita per creare differenze di concentrazione e volume.

Queste differenze fanno sì che gli assoni, le proiezioni neuronali più lunghe, crescano verso i pozzetti distali attraverso i microsolchi.

Aggiungere una soluzione colorante fluorescente in entrambi i pozzetti.

Le molecole di colorante entrano nei neuroni e colorano i mitocondri e gli organelli acidi ad entrambe le estremità.

Nell'imaging confocale dal vivo, gli organelli colorati in fluorescenza si muovono in entrambe le direzioni tra i corpi cellulari neurali e gli assoni, confermando il trasporto assonale nei motoneuroni.

Smaltire tutto il fluido dal compartimento prossimale dell'MFC. Prelevare un singolo espianto di midollo spinale con una pipetta in un volume totale di quattro microlitri e iniettarlo il più vicino possibile alla grotta. Estrarre il liquido in eccesso dal pozzetto prossimale attraverso le uscite laterali. Ripeti il passaggio precedente altre due volte e assicurati che gli espianti siano incorporati nel canale prossimale. Aggiungere lentamente, 150 microlitri di terreno SCEX nel pozzetto prossimale.

Un giorno dopo la piastratura, sostituire il terreno SCEX nel compartimento prossimale e aggiungere un ricco terreno SCEX al compartimento distale, mantenendo un gradiente di volume di almeno 15 microlitri per pozzetto tra i pozzetti distale e prossimale. Dopo quattro-sei giorni, gli assoni dovrebbero attraversare il compartimento distale ed essere pronti per l'imaging del trasporto assonale.

Per etichettare i mitocondri e i compartimenti acidi, preparare un terreno SCEX fresco con Mitotracker 100 nanomolari rosso intenso FM e 100 nanomolari LysoTracker rosso e aggiungerlo alle camere microfluidiche. Incubarli per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius, quindi lavare tre volte con terreno SCEX caldo. Procedere con l'imaging dal vivo del trasporto assonale, acquisendo una serie di immagini in intervallo di 100 tempi a intervalli di 3 secondi con un totale di 5 minuti per filmato.