JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:51 min • July 8th, 2025
Prendi un topo soppresso.
Aprire l'addome, asportare la vescica e immergerla nel tampone.
Tagliare la vescica e rimuovere il grasso aderente e i detriti di tessuto.
Trasferire la vescica in una provetta contenente tampone, centrifugare e rimuovere i detriti.
Mettere il fazzoletto in una soluzione contenente collagenasi e tritarlo. Aggiungere altra collagenasi per degradare la matrice extracellulare, allentando le cellule.
Centrifugare ed eliminare il surnatante. Aggiungere tripsina per interrompere le giunzioni cellula-cellula, rilasciando le cellule.
Aggiungere il mezzo di risciacquo contenente proteine per inattivare la tripsina, quindi centrifugare e rimuovere il surnatante.
Risospendere le cellule in un terreno, filtrarle per rimuovere gli aggregati e ottenere una sospensione a cella singola.
Centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le celle nel terreno.
Placcare le cellule su vetrini coprioggetti rivestiti per facilitare l'adesione delle cellule neuronali e gliali. Rimuovere le celle non collegate.
Aggiungere mezzi neuronali contenenti fattori di crescita per promuovere la maturazione cellulare, stabilendo una coltura neuronale e gliale primaria.
Inizia mettendo i ratti su un asciugamano chirurgico sterilizzato ed esponendo l'addome. Usa forbici e pinze per aprire la cavità addominale e rivelare la vescica. Usa un altro set di forbici e pinze per sollevare delicatamente la vescica e tagliarla dal collo della vescica.
Quindi, posizionare rapidamente la vescica in una soluzione di Krebs fredda e stabile all'ossigeno per migliorare la sopravvivenza cellulare. Aggiungere la soluzione di Krebs in tre piatti di vetro e tre bicchieri di vetro e metterli in un bagno di ghiaccio per il pre-raffreddamento. Numera i piatti e i bicchieri 1, 2 e 3 per evitare confusione.
Nel piatto di vetro 1, aprire la vescica con le forbici oftalmiche e aprirla con una pinza e un divisore del nucleo a cucchiaio. Sciacquare la camera d'aria nel bicchiere di vetro 1 e metterla nel piatto di vetro 2. Elimina il grasso aderente sulla superficie del tessuto utilizzando le pinze e le forbici oftalmiche. Quindi, sciacquare la vescica nel bicchiere 2 e metterla nel piatto 3.
Raschiare delicatamente la vescica usando la pinza e il divisore del nucleo del cucchiaio per rimuovere gli attacchi esogeni. Sciacquare la vescica nel becher di vetro 3 e trasferirla in una provetta da centrifuga da 15 millilitri con 14 millilitri di soluzione fredda di Krebs. Centrifugare il campione per 1 minuto a 360 volte g e 4 gradi Celsius.
Trasferire la vescica dalla provetta da centrifuga in una fiala da 2 millilitri contenente 1 millilitro di soluzione digestiva. Usa le forbici oftalmiche per tagliare la vescica in piccoli pezzi. Mescolare la soluzione vescicale con 9 millilitri di soluzione digestiva 1 in una piastra sterile per colture cellulari. Eseguire la prima digestione in un'incubatrice agitata per 1 ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica a 200 giri/min. Dopo la prima digestione, centrifugare la soluzione a 300 volte g e 4 gradi Celsius per 8 minuti.
Nel frattempo, mettere la soluzione digestiva 2 in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per il preriscaldamento. Dopo la centrifugazione, rimuovere la maggior parte del surnatante che contiene la soluzione di digestione 1, lasciando un po' di surnatante per evitare la perdita cellulare.
Risospendere le cellule in una soluzione di digestione calda 2 e agitare la miscela mentre si digerisce in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 5 minuti. Una volta completata la digestione, disattivare immediatamente la tripsina aggiungendo 10 millilitri di mezzo di risciacquo freddo. Centrifugare le celle a 360 volte g e 4 gradi Celsius per 8 minuti. Quindi, rimuovere quanto più surnatante possibile per eliminare tutta la tripsina.
Risospendere delicatamente il sedimento con 3 millilitri di mezzi neuronali, facendo attenzione a non generare bolle d'aria nella soluzione. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 360 volte g a 4 gradi Celsius per 8 minuti. Quindi, risospendere delicatamente i pellet cellulari in 1 millilitro di neurone medio A e aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Colture di cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.