Coltura di neuroni murini primari compartimentati utilizzando chip microfluidici in plastica

Prendiamo un chip microfluidico di plastica comprendente serbatoi somatici e compartimenti, nonché serbatoi assonali e compartimenti, collegati da microscanalature.

Aggiungere una soluzione di pre-rivestimento per saturare gli scomparti e le scanalature, prevenendo l'intrappolamento di bolle d'aria.

Aspirare la soluzione, lasciando pieni gli scomparti principali. Lavare con tampone.

Rivestire i pozzetti con un polimero sintetico che facilita l'adesione neuronale. Lavare con tampone e aggiungere terreni di coltura per evitare che il chip si secchi.

Per seminare una sospensione di neuroni dell'ippocampo di ratto, aspirare il terreno.

Caricare la sospensione nei serbatoi somatici. I neuroni entrano e si attaccano al compartimento somatico.

Aggiungere terreni di coltura neuronale ai pozzetti e incubare. I fattori di crescita presenti nei terreni facilitano la crescita neuronale.

A poco a poco, i neuroni estendono i loro assoni, che crescono nel compartimento assonale attraverso i microsolchi.

La ristrettezza dei solchi impedisce l'ingresso dei corpi cellulari neuronali, garantendo la separazione fisica delle regioni somatiche e assonali.

Per iniziare, metti un chip multiscomparto sterile in una capsula di Petri. Aggiungere 100 microlitri di una soluzione di prerivestimento nel pozzetto superiore sinistro del truciolo e lasciarlo fluire attraverso il canale principale nel pozzetto adiacente. Quindi, riempire il pozzetto inferiore sinistro del chip con 100 microlitri della soluzione di prerivestimento.

Questa volta, attendi cinque minuti per consentire alla soluzione di fluire attraverso le microscanalature. Ora, aggiungi 100 microlitri della soluzione di prerivestimento nel pozzetto in alto a destra e lascialo fluire attraverso il canale principale nel pozzetto adiacente. Dopo 90 secondi, riempire il pozzetto in basso a destra con 100 microlitri della soluzione di prerivestimento e incubare il chip per 10 minuti.

Inclinare con cautela la punta della pipetta lontano dal canale principale e aspirare la soluzione da ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere immediatamente 150 microlitri di PBS nella parte superiore sinistra e attendere 1,5 minuti. Quindi, aggiungi 150 microlitri di PBS nel pozzetto in basso a sinistra e attendi cinque minuti per consentire al liquido di fluire attraverso i microsolchi.

Quindi, aggiungi 150 microlitri di PBS ai pozzetti in alto a destra e in basso a destra in quest'ordine. Dopo 10 minuti, aspirare nuovamente il PBS e ripetere le fasi di lavaggio una seconda volta. Dopo il secondo lavaggio, aspirare i pozzetti del PBS come in precedenza inclinando la punta della pipetta lontano dall'apertura del canale.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione di poli-D-lisina da 0,5 mg per ml nel pozzetto superiore sinistro del chip. Attendere 1 minuto e 1/2 e poi riempire il pozzetto in basso a sinistra con 100 microlitri della soluzione di poli-D-lisina. Ripeti questo processo sulla metà destra del chip. Chiudere la capsula di Petri, quindi posizionare il chip in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, sciacquare il chip due volte con PBS come descritto in precedenza. Quindi, aspirare il PBS dal dispositivo. Immediatamente, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare nel pozzetto in alto a sinistra del chip. Dopo 1 minuto e 1/2, aggiungi i media nel pozzetto in basso a sinistra.

Attendere cinque minuti per consentire al fluido di fluire attraverso le microscanalature, quindi ripetere il processo di riempimento sul lato destro del chip. Preparare una sospensione cellulare di neuroni ippocampali di ratto dissociati secondo i protocolli stabiliti. Rimuovi la maggior parte dei supporti in ogni pozzetto del chip, ma lascia i canali pieni.

Quindi caricare immediatamente 5 microlitri di sospensione cellulare nel pozzetto in alto a destra e altri 5 microlitri di sospensione cellulare nel pozzetto in basso a destra. Quando si caricano le cellule, puntare la punta della pipetta verso il canale principale. Dopo aver caricato le cellule, trasferire il chip su un tavolino da microscopio per assicurarsi che i neuroni si trovino nel canale principale.

Dopo aver atteso 5 minuti affinché le cellule si attacchino, aggiungere circa 150 microlitri di terreno di coltura neuronale a ciascuno dei pozzetti superiore e inferiore destro. Quindi, aggiungere 150 microlitri di terreno in ciascuno dei pozzetti superiore e inferiore sinistro. Copri la capsula di Petri e metti la patatina in un vassoio umidificato in un'incubatrice al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.