Riprogrammazione neuronale diretta di astrociti di topo in neuroni

Inizia con una piastra a più pozzetti contenente astrociti geneticamente modificati. Queste cellule sono fatte aderire a un vetrino coprioggetti posto in un mezzo astrocitario.

Queste cellule geneticamente modificate esprimono fattori di trasformazione che forzano la loro transizione nei neuroni. Questo processo è chiamato riprogrammazione neuronale.

Prendi un terreno di differenziazione neuronale contenente molecole specifiche e l'integratore di B27. Insieme, questi componenti forniscono nutrienti essenziali e fattori di differenziazione.

Sostituire il mezzo astrocitario con il mezzo di differenziazione neuronale.

Incubare gli astrociti per la durata richiesta.

Durante l'incubazione, i fattori di trasformazione espressi dagli astrociti innescano una sequenza di eventi molecolari che consentono la conversione di un astrocita in un neurone.

I neuroni convertiti hanno corpi cellulari più piccoli e processi allungati, simili ai neuroni tipici.

Preparare il terreno di differenziazione neuronale aggiungendo un millilitro di integratore di B27 a 49 millilitri di terreno di coltura di base. Dopo 24-48 ore, a seconda che le cellule siano state trasdotte o trasfettate, sostituire il terreno degli astrociti con un millilitro di terreno di differenziazione neuronale per pozzetto. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con il 9% di anidride carbonica.

Per aumentare l'efficienza della riprogrammazione, integrare il mezzo di differenziazione neuronale con Forskolina e Dorsomorfina a una concentrazione finale di 30 micromolari e un micromolare rispettivamente quando si sostituisce il mezzo astrocitario con il mezzo di differenziazione. Quando si sceglie di trattare le cellule con Forskolina e Dorsomorfina, somministrare una seconda dose di Dorsomorfina due giorni dopo il trattamento iniziale. Aggiungere questo secondo trattamento direttamente al terreno di coltura.