Preparazione di fette di cervello a cuneo per visualizzare i neuroni uditivi

Inizia con il cervello di un topo e sezionalo orizzontalmente sotto la parte posteriore per preservare i neuroni uditivi cruciali per l'elaborazione del suono.

Montare la sezione posteriore su un disco magnetico. Posizionare un blocco di agar per stabilizzare il tessuto durante l'affettatura.

Trasferire la sezione sul tavolino di una camera di affettamento di un vibratomo dotato di lama.

Introdurre un tampone freddo e un gas carbogeno a bolle che fornisce ossigeno e preserva l'integrità dei neuroni.

Fai un taglio orizzontale uniforme per rimuovere la parte superiore della sezione del cervello.

Quindi, inclinare il tavolino e continuare a tagliare la sezione rimanente fino a quando la radice del nervo uditivo non è visibile.

Riallineare lo stage. Quindi, ruotalo e regola la posizione della lama per lo spessore desiderato del bordo sottile della fetta.

Allontanare la lama e riallineare il tavolino nella posizione precedente. Ora, affetta il cervello a forma di cuneo, più spesso da un lato e più sottile dall'altro.

Il lato più spesso include la radice nervosa uditiva, mentre il lato più sottile presenta neuroni uditivi interconnessi.

Inizia usando una lama di rasoio per tagliare la pelle sulla linea mediana del cranio dal naso alla parte posteriore del collo. Stacca la pelle per esporre il cranio e, partendo dalla base del cranio e proseguendo verso il naso, usa piccole forbici per praticare un'incisione nel cranio attraverso la linea mediana.

Alla sutura lambda, praticare dei tagli nel cranio dalla linea mediana lateralmente verso l'orecchio su entrambi i lati per staccare il cranio e esporre il cervello. Partendo dall'estremità rostrale, usa una piccola spatola da laboratorio per sollevare delicatamente il cervello dal cranio per consentire ai nervi ottici di essere recisi.

Continua a lavorare delicatamente il cervello all'indietro, esponendo la superficie ventrale, e usa una pinza sottile per pizzicare con cura i nervi trigemino vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico per tagliarli. Mettere la preparazione in una capsula di Petri di vetro riempita con una soluzione fredda per affettare e posizionare la piastra sotto un microscopio da dissezione. Taglia i nervi facciali vicino al tronco encefalico per esporre i nervi vestibolococleari.

Usa una pinza fine per spingere le punte nei forami dove il nervo vestibolococleare esce dal cranio il più lontano possibile. Pizzica per recidere i nervi su entrambi i lati, lasciando la radice nervosa attaccata al tronco encefalico.

Rimuovere le meningi e il sistema vascolare dalla superficie ventrale del tronco encefalico vicino al corpo trapezoidale. Quindi, pizzica i nervi cranici rimanenti e il tessuto connettivo per liberare completamente il cervello dal cranio, avendo cura di preservare il midollo spinale rimanente, se possibile.

Per preparare la superficie del cervello per il fissaggio al palco, posizionare il lato ventrale del cervello verso l'alto e utilizzare uno strumento smussato per immobilizzare delicatamente il midollo spinale per stabilizzare il tessuto cerebrale. Inserire la pinza aperta con un angolo di circa 20 gradi attraverso il cervello fino al fondo del piatto in modo che le punte escano dalla superficie dorsale del cervello caudale fino al chiasma ottico e utilizzare una lama di rasoio per tagliare lungo la pinza.

Successivamente, prepara un blocco di un centimetro cubo di agar al 4% e stendine una piccola goccia di colla in un rettangolo sul palco. Usa una pinza per sollevare con cura il cervello e tamponare delicatamente il liquido in eccesso con il bordo di un tovagliolo di carta. Quindi, posizionare la superficie bloccata sulla colla in modo che la superficie ventrale sia rivolta nella direzione della lama durante l'affettatura e spingere delicatamente il blocco di agar contro la superficie dorsale come supporto.

Per acquisire fette di cuneo con la radice del nervo cocleare sul lato spesso e i neuroni mediali, olivocochlocleari e il nucleo mediale del corpo trapezoidale sul lato sottile, posizionare il disco magnetico con il cervello attaccato sul supporto del tavolino e posizionare il supporto nella camera di taglio di un vibratomo con la superficie ventrale del cervello orientata verso la lama. Riempire la camera con una soluzione per affettare ghiacciata e immergere la lama nella soluzione bollata di carbogeno.

Tagliare le fette caudalmente alla regione di interesse per assicurarsi che le fette siano simmetriche. Quindi, spostare il tavolino di circa 15 gradi su un lato. Continua ad affettare con cura fino a quando la radice del nervo uditivo non è vicina alla superficie su un lato e il nervo facciale può essere visto sulla superficie dell'altro lato della fetta.

Riportare il tavolino di 15 gradi nella posizione originale e allontanare la lama dal tessuto. Ruotare la base del tavolino di 90 gradi in modo che il bordo laterale del lato sottile sia rivolto verso la lama e abbassare la lama di diverse centinaia di micron prima di avvicinare lentamente la lama al bordo del tessuto. Con la lama leggermente retratta, abbassare la lama allo spessore desiderato del bordo sottile della fetta.

Spostare la lama indietro dal tessuto e ruotare la base del tavolino all'indietro in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso la base del tavolino. Fai un taglio per designare la superficie rostrale della fetta a cuneo e trasferisci la fetta su un pezzo di carta di interfaccia di un centimetro quadrato. superficie caudale verso il basso.

Il nervo facciale dovrebbe essere visibile su entrambi gli emisferi della fetta sulla superficie rostrale. Quindi, spostare la fetta in una camera di incubazione a 35 gradi Celsius per recuperare per 30 minuti.