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Inizia con le cellule nervose coltivate in un mezzo di differenziazione cellulare.
Aggiungi nanobarre d'oro nel mezzo.
Incubare per consentire alla cellula di inghiottire il nanorod attraverso un processo chiamato endocitosi.
Stimola le nanobarre con un laser.
Il raggio laser eccita gli elettroni di superficie sulla nanorod. Gli elettroni eccitati ritornano quindi allo stato fondamentale, rilasciando energia termica.
Questo calore stimola le cellule nervose a produrre proiezioni supportate da una specifica proteina del citoscheletro chiamata βIII-tubulina.
Rimuovere il mezzo esaurito.
Correggi le celle. Aggiungere un detergente adatto per permeabilizzare la membrana.
Aggiungere un agente bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.
Etichettare le cellule con anticorpi primari che hanno come bersaglio la βIII-tubulina.
Aggiungere anticorpi secondari marcati in fluorescenza che interagiscono con gli anticorpi primari.
Colorare il nucleo con un colorante fluorescente blu.
Utilizzando la microscopia a epifluorescenza, osservare le cellule di colore rosso con nuclei blu.
Le proiezioni allungate della cellula indicano la differenziazione delle cellule nervose.
Far crescere le cellule neuronali NG108-15 in 10 millilitri di terreno di coltura cellulare in un pallone T75, successivamente incubarle a 37 gradi Celsius in atmosfera umidificata. Quando le celle sono confluenti al 70%-80%, cambiare il terreno con un terreno caldo e fresco.
Successivamente, staccare meccanicamente le cellule battendo delicatamente il fondo del pallone confluente. Centrifugare una sospensione cellulare per cinque minuti a 600 g e risospendere il pellet cellulare in 2 millilitri di terreno di differenziazione cellulare caldo. Quindi, seminare le cellule in una piastra a 96 pozzetti, con 200 microlitri di terreno di differenziazione cellulare.
Incubare il campione per un giorno a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aggiungere la soluzione di nanorod d'oro e incubarla per altre 24 ore. In questa procedura, accoppiare il laser con una fibra ottica monomodale e terminarla con un connettore FC. Misura la potenza del laser in uscita con un misuratore di potenza standard.
Il giorno 3 di incubazione delle nanobarre, fissare il connettore FC al pozzetto, irradiare il campione e il controllo a temperatura ambiente per 1 minuto in un'onda continua a diverse potenze laser. Il giorno 5, rimuovere il mezzo di differenziazione cellulare dal campione e fissarlo con una soluzione di formaldeide al 3,7% in volume per volume per 10 minuti.
Quindi, permeabilizzare le cellule con lo 0,1% di volume per volume di Triton X-100 per 20 minuti. Successivamente, aggiungere il 3% in peso per volume di BSA al campione per 60 minuti per bloccare i siti di legame della proteina non reagiti. Etichettare il campione con anti-beta-3-tubulina per una notte a 4 gradi Celsius.
Il giorno successivo, incubare le cellule per 90 minuti al buio, con un anticorpo secondario appropriato. Successivamente, etichettare i nuclei cellulari con DAPI per 10 minuti, quindi visualizzare il campione con epifluorescenza o microscopia confocale, utilizzando un obiettivo almeno 20x. Scegliere i filtri del microscopio in base all'anticorpo secondario e selezionare il filtro DAPI per visualizzare i nuclei cellulari.