Generazione di colture cellulari primarie di ganglio retinico da embrioni di zebrafish

Inizia con embrioni di pesce zebra in fase iniziale di sviluppo in terreni embrionali.

Rimuovere il corion, la membrana protettiva che circonda gli embrioni, e trasferire gli embrioni in una piastra di coltura fresca contenente terreni.

Rimuovere la parte della coda dell'embrione, quindi separare la testa e staccare delicatamente gli occhi dalla testa.

Gli occhi contengono la retina, un sottile strato di tessuto che ospita le cellule gangliari retiniche.

Trasferire gli occhi in una provetta contenente terreni di coltura cellulare di pesce zebra.

Dissociare meccanicamente gli occhi per rilasciare le cellule gangliari retiniche e formare una sospensione unicellulare.

Prelevare i vetrini coprioggetti posti in una piastra di coltura contenente terreni di coltura di pesce zebra.

I vetrini coprioggetti sono rivestiti con un polimero sintetico e una proteina di adesione.

Trasferire le cellule al centro del vetrino coprioggetti e incubare.

Le cellule gangliari retiniche si attaccano alle superfici rivestite e, inoltre, queste cellule sviluppano lunghe proiezioni chiamate assoni.

Recupera gli embrioni di zebrafish dall'incubatrice e immergi gli embrioni in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente il 70% di etanolo, per 5-10 secondi per sterilizzarli. Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire gli embrioni nel terreno E2 #1 contenente terreno E2 sterile per lavare via l'etanolo in eccesso. Quindi, trasferisci gli embrioni nella capsula E2 Media #2 e rimuovi i loro corioni con una pinza affilata. Infine, trasferire gli embrioni nella capsula E2 Media #3 per eseguire le dissezioni.

Usando un paio di pinze sottili, posiziona e tieni gli embrioni anteriormente al tuorlo con una delle pinze e rimuovi la coda posteriormente al sacco vitellino con le altre pinze. Afferra il collo con una pinza e stacca la testa per esporre il cervello e gli occhi ai mezzi E2. Con la punta di una pinza sottile, ruota delicatamente gli occhi dalla testa tenendo premuto il tessuto cranico con la seconda pinza. Trasferire quattro occhi in una delle provette precedentemente preparate contenenti ZFCM+.

Triturare delicatamente su e giù con la pipetta P20 circa 45 volte per dissociare le cellule. Trasferire lo ZFCM+ con le cellule dissociate al centro dei vetrini. Mantenere le colture sul banco di lavoro a 22 gradi Celsius, su un rack di polistirene espanso per assorbire le vibrazioni. Il giorno dell'imaging, controllare le cellule al microscopio per convalidare la crescita degli assoni RGC.