JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:06 min. • July 8th, 2025
Inizia aggiungendo cellule neuronali a un terreno adatto in un piatto di coltura.
Aggiungere nanoparticelle magnetiche fluorescenti, o MNP, contenenti un nucleo magnetico etichettato con un colorante fluorescente.
Durante l'incubazione, la cellula assorbe l'MNP attraverso l'endocitosi e si magnetizza.
Posizionare un substrato modellato magnetizzato pulito in un piatto di coltura. Questo substrato di vetro ha modelli geometrici incorporati con proprietà magnetiche.
Sterilizzare il substrato esponendolo alla luce ultravioletta.
Rivestire il substrato con collagene per favorire l'adesione delle cellule.
Aggiungere le cellule caricate con MNP al substrato e incubare.
Il campo magnetico esterno del substrato attrae le celle caricate con MNP, consentendone l'aggancio.
Aggiungere un terreno contenente un fattore di crescita specifico a intervalli regolari.
Il fattore di crescita aiuta le cellule a formare estensioni, mentre il modello magnetico del substrato dirige l'orientamento di queste estensioni.
Semina 1 milione di cellule in un piatto normale da 35 millimetri non rivestito. Aggiungere il volume calcolato di sospensione di MNP e il mezzo di differenziazione alla piastra per ottenere la concentrazione di MNP desiderata. Mescolare le cellule, gli MNP e il mezzo di differenziazione, quindi incubare la capsula in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Pulire il substrato modellato con etanolo al 70% e posizionarlo in un piatto di coltura da 35 millimetri nella cappa. Posiziona un grande magnete sotto il substrato modellato per un minuto, quindi rimuovilo spostando il piatto verso l'alto e lontano e togliendo il magnete dal cofano. Accendi la luce ultravioletta per 15 minuti.
Per preparare un substrato di vetro rivestito di collagene, diluire il collagene di tipo I in un rapporto da 1 a 50 in etanolo al 30%. Copri il bicchiere con la soluzione. Lasciare la pirofila scoperta nella cappa per quattro ore fino a quando tutta la soluzione evapora. Quindi, lavalo tre volte in PBS sterile. Rimuovere le cellule dall'incubatore. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 g ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 millilitro di terreno di differenziazione fresco e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
Seminare 105 cellule sopra il substrato in un piatto di coltura da 35 millimetri e aggiungere 2 millilitri di terreno di differenziazione. Incubare la coltura in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, aggiungere da 1 a 100 beta-NGF murino fresco alle cellule. Rinnovare il mezzo di differenziazione e aggiungere beta-NGF fresco ogni due giorni.