Preparazione di colture a fette fluttuanti da un cervello umano adulto

Prendete un tessuto cerebrale umano immerso in una soluzione di affettatura. Il pH biologico e i nutrienti della soluzione aiutano a mantenere la funzionalità dei tessuti.

Rimuovere lo strato più esterno delle meningi e tagliare il tessuto per creare una superficie piana.

Eliminare la soluzione in eccesso dal tessuto. Fissare il tessuto tagliato a un disco campione con un blocco di agarosio, mantenendo il tessuto a contatto con il blocco per facilitare il sezionamento.

Metti il disco in una vaschetta tampone per vibratomo e copri il fazzoletto con una soluzione per affettare ghiacciata.

Utilizzando il vibratomo, generare fette uniformi che preservano l'architettura del tessuto.

Taglia il tessuto in eccesso, assicurandoti una proporzione costante di materia grigia e bianca.

Mettere le fette in una piastra a pozzetti multipli contenente un terreno di coltura e incubare.

Le fette rimangono sospese nel terreno per garantire un accesso uniforme ai nutrienti, una tecnica nota come coltura a fette libere.

Rifornire regolarmente la coltura con un terreno integrato con fattore di crescita neurale per mantenere la vitalità dei tessuti.

Trasferire il campione in una capsula di Petri contenente una soluzione per affettare. Utilizzando strumenti chirurgici fini, rimuovere con cura la maggior parte possibile delle meningi rimanenti. Scegliere il miglior orientamento del provino per la produzione di fette con le particolari caratteristiche del disegno sperimentale e utilizzare una lama di bisturi numero 24 per rifilare una superficie piana che sarà la base che verrà incollata al disco del campione.

Usando un cucchiaio di plastica usa e getta e pennelli delicati, raccogli il frammento dalla capsula di Petri e asciuga la soluzione in eccesso con carta da filtro. Quindi, utilizzare la super colla per attaccare il tessuto alla piastra del campione di vibratomo fino a quando non aderisce saldamente alla piastra e viene a contatto con il blocco di agarosio.

Posizionare il disco del campione del vibratomo nel vassoio del tampone del vibratomo. Bloccare il portacoltello in posizione con la lama del rasoio saldamente fissata. Aggiungere la soluzione per affettare e assicurarsi che copra sia il campione che la lama. Quindi, inizia ad affettare il campione in fette da 200 micrometri.

Trasferire le fette dal vassoio del tampone in una capsula di Petri contenente la soluzione per affettare e tagliare i bordi allentati e la sostanza bianca in eccesso fino a una proporzione di circa il 70% di corteccia e il 30% di sostanza bianca. In una cappa a flusso laminare, aggiungere 600 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare a 36 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno 20 minuti prima di impiattare le fette. Dopodiché, usa un pennello per impiattare una fetta in ogni pozzetto.

Se nella piastra sono presenti pozzetti inutilizzati, riempirli con 400 microlitri di acqua sterile. Incubare a 36 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Integrare 10 millilitri del terreno di coltura precedentemente preparato con fattore neurotrofico derivato dal cervello a una concentrazione di 50 nanogrammi per millilitro.

Dopo 8-16 ore, rimuovere 333 microlitri del terreno condizionato da ciascun pozzetto e aggiungere 133 microlitri di terreno fresco integrato con BDNF. Sostituire un terzo del terreno condizionato con un terreno fresco integrato con BDNF ogni 24 ore.