Isolamento e coltura di microglia da cervelli di ratto utilizzando terreni privi di siero

Prendete un cervello di ratto perfuso. Tritarlo in piccoli frammenti.

Omogeneizzare il tessuto in un tampone per rilasciare le cellule, compresa la microglia.

Una volta che il tessuto non digerito si è depositato, raccogliere il surnatante contenente le cellule e aggiungere un tampone di separazione della mielina.

Mescolare il contenuto e centrifugare per separare le cellule dalla mielina e dai detriti. Rimuovere lo strato di detriti di mielina e il surnatante.

Risospendere le cellule nel tampone e nella pipetta per separare i grumi.

Passare la sospensione attraverso un colino per rimuovere gli aggregati cellulari rimanenti.

Trasferire le cellule filtrate in una piastra di coltura rivestita con anticorpi monoclonali specifici per la microglia. Incubare per facilitare l'adesione della microglia.

Lavare con tampone per rimuovere le cellule non aderenti. Aggiungere la tripsina e incubare per sciogliere la microglia.

Rimuovere la tripsina.

Aggiungere terreni privi di siero. Incubare su ghiaccio per indebolire le interazioni cellula-substrato.

Pipettare e raccogliere la sospensione in una provetta. Centrifugare e rimuovere il surnatante.

Risospendere la microglia in un terreno privo di siero e trasferirla su una piastra multipozzetto rivestita di collagene. Incubare per facilitare l'adesione della microglia.

Aggiungere terreni con fattori di crescita e lipidi. Incubare per la maturazione della microglia.

Dopo che i cervelli sono stati raccolti in DPBS freddo, tagliare ogni cervello in pezzi di un millimetro cubo in una capsula di Petri su ghiaccio con una lama di bisturi fredda e trasferirli in un omogeneizzatore Dounce ghiacciato con 5-7 millilitri di tampone douncing ghiacciato. Successivamente, utilizzare un omogeneizzatore Dounce largo per dissociare il tessuto con 10-20 passaggi delicati e incompleti. Fare attenzione a non schiacciare direttamente il fazzoletto sul fondo dell'omogeneizzatore. Invece, spingere il tessuto attraverso lo spazio tra i lati del pistone e l'omogeneizzatore.

È importante omogeneizzare lentamente il tessuto con più cicli di douncing per preservare la vitalità della microglia.

Successivamente, rimuovere con cautela il pistone per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Lasciare che i pezzi di tessuto scarsamente dissociati si depositino sul fondo dell'omogeneizzatore e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 50 millilitri raffreddata. Successivamente, sostituire il volume rimosso con un tampone douncing fresco e ripetere la procedura di dissociazione per un totale di tre o quattro cicli, o fino a quando tutto il tessuto non è stato dissociato.

In questa procedura, aggiungere un tampone di dosaggio ghiacciato al tubo conico da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare e regolare il volume totale a 33,5 millilitri. Quindi, aggiungere 10 millilitri di MSB alla sospensione cellulare e mescolare accuratamente capovolgendo il tubo più volte. Ciò si tradurrà in una concentrazione finale del 23% di MSB in un volume di 43,5 millilitri.

Dopodiché, centrifugare le celle per 15 minuti a 500 g a 4 gradi Celsius frenando lentamente. Quindi, rimuovere lo strato superiore di mielina, i detriti e il surnatante con una pipetta. Fare attenzione quando si rimuove lo strato superiore per assicurarsi che venga rimosso il più possibile.

Successivamente, risospendere il pellet della cella in 12 millilitri di tampone di panning. Triturare delicatamente la sospensione cellulare, per rompere eventuali grumi di cellule rimanenti. In questa fase, passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri per rimuovere detriti di grandi dimensioni o grumi di cellule. Sciacquare tre volte la pirofila rivestita in OX42 con DPBS. Non lasciare che la piastra si asciughi completamente tra un lavaggio e l'altro.

Versare l'ultimo lavaggio DPBS e applicare la sospensione cellulare filtrata sulla pirofila. Agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule. Quindi, incubare la piastra su una superficie piana a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire alle cellule di aderire. Non incubare per più di 20 minuti, altrimenti le cellule diventeranno molto difficili da recuperare dal piatto. Successivamente, sciacquare la teglia con DPBS 10 volte per rimuovere le cellule non aderenti.

La microglia sarà saldamente attaccata alla piastra, quindi agitare la piastra ad ogni risciacquo per garantire la rimozione di altre cellule non aderenti. Versare l'ultimo lavaggio DPBS e sostituirlo con 15 millilitri di DPBS e 200 microlitri di tripsina.

Per tripsinizzare le cellule, incubare la capsula per meno o uguale a 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti di tripsinizzazione, la microglia sarà ancora attaccata alla piastra. Versare il composto e lavare delicatamente la piastra due volte con DPBS per rimuovere la tripsina. Quindi, sostituire con 12 millilitri di MGM ghiacciato.

Successivamente, posizionare la pirofila sul ghiaccio per due minuti per indebolire l'interazione tra cellula e substrato e assicurarsi che la pirofila sia piatta per evitare che le aree della pirofila si secchino. Successivamente, pipettare energicamente con una pipetta da 10 millilitri e un controller per pipette ad alta velocità per recuperare le cellule dal piatto di panoramica. Disegna una griglia 16 per 16 con il flusso di liquido dalla pipetta per cercare di rimuovere tutte le cellule.

È importante trovare un equilibrio tra il recupero cellulare generale e la salute della coltura. Il pipettaggio ripetuto di un surnatante cellulare contro il piatto di panning comporterà una riduzione della vitalità della coltura.

Controllare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 20x per assicurarsi che si siano staccate dalla piastra. Contrassegnare i punti sulla parte superiore della piastra in cui sono bloccate le cellule e ripetere il pipettaggio in quelle aree. Raccogliere la sospensione cellulare e aliquotare da 3 a 4 millilitri di surnatante in ogni provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare per 15 minuti a 500 g a 4 gradi Celsius con una frenata lenta.

Dopo 15 minuti, aspirare il surnatante, lasciando 0,5 millilitri di MGM con il pellet cellulare. Quindi, risospendere ogni pellet nell'MGM rimanente e riunire le cellule da tutte le provette. Successivamente, contare le cellule con l'emocitometro.

Ora, piastrate 15 microlitri di rivestimento di collagene IV direttamente al centro di una piastra di coltura tissutale anionica a 24 pozzetti, rivestita cationicamente, e incubate per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, diluirle a 2,3 x ^10-5 per millilitro in MGM. Aspirare il collagene IV e piastrare immediatamente 15 microlitri di sospensione cellulare in questo punto per ottenere 3,5 x 10³ cellule per punto.

Quindi, incubare per cinque-dieci minuti a 37 gradi Celsius per consentire alle cellule di aderire. Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri di TIC CO_{2-equilibrato} nel pozzetto.