Isolamento e coltura di cellule staminali neurali adulte dalla zona sottocallosa del topo

Inizia con un cervello di topo su una matrice cerebrale raffreddata.

Ottieni sezioni contenenti la zona sottocallosa o SCZ. Trasferire la sezione in un tampone fosfato freddo.

Sotto un microscopio da dissezione, ritagliare la parte SCZ.

Taglia l'SCZ sezionato in pezzi più piccoli.

Trasferisci questi pezzi in un tampone per la digestione. Incubare per dissociare le cellule dal tessuto.

Centrifugare ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in un mezzo adatto.

Trasferire le cellule su una piastra di coltura e aggiungere fattori di crescita specifici.

Le cellule staminali neurali adulte si dividono, formando gruppi chiamati neurosfere.

Una distribuzione impropria dei nutrienti nei gruppi cellulari limita la crescita cellulare.

Per disperdere i grappoli, centrifugare e scartare il surnatante. Risospendere i cluster in un buffer di dissociazione e incubarli.

Pipettare la soluzione su e giù per generare singole cellule.

Centrifugare ed eliminare il surnatante.

Risospendere le cellule e trasferirle in un mezzo adatto per ottenere un monostrato.

Una volta sezionato, trasferire il cervello del topo in un tampone PBS freddo e sciacquarlo due volte per rimuovere il sangue in eccesso. Quindi, posiziona il cervello nella matrice cerebrale sul ghiaccio e fai dei tagli coronali per ottenere fette spesse un millimetro. Successivamente, trasferire le fette cerebrali posteriori contenenti le regioni SCZ al PBS freddo.

Sotto un microscopio da dissezione a basso ingrandimento, sezionare microdossamente l'SCZ dall'area della sostanza bianca della corteccia e dell'ippocampo con un ago piegato di calibro 30. Quindi, rimuovere le regioni della corteccia sopra l'SCZ e posizionare l'SCZ sezionato in PBS freddo in una capsula di Petri da 35 millimetri su ghiaccio.

La regione della zona sottocallosa può essere sezionata con precisione dall'intero tessuto utilizzando la matrice cerebrale e l'ago piegato calibro 30.

Successivamente, rimuovere il PBS, quindi tagliare immediatamente i tessuti sezionati in piccoli pezzi. Risospendili con un millilitro di tampone digestivo. Successivamente, trasferire il campione in una provetta da 15 millilitri contenente due millilitri di tampone per la digestione. Quindi, incubarlo per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

In questa fase, picchiettare delicatamente la provetta per dissociare il tessuto digerito, quindi centrifugare la provetta a 145 volte g per cinque minuti. Dopo cinque minuti, scartare il surnatante, risospendere il tessuto digerito con un millilitro di terreno preriscaldato e due di terreno per lavare via il tampone di digestione e pipettare delicatamente la soluzione del campione per un massimo di cinque volte.

Quindi, centrifugare nuovamente il campione a 145 volte g per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno N2. Mettere un millilitro di terreno N2 in una piastra a sei pozzetti non rivestita e aggiungere un millilitro di celle sospese per ottenere un volume finale di due millilitri.

Quindi, aggiungere 20 nanogrammi per millilitro di EGF e 20 nanogrammi per millilitro di bFGF in ciascun pozzetto. Agitare delicatamente a mano la piastra di coltura a sei pozzetti per mescolare i fattori di crescita aggiunti con le cellule piastre. Quindi, conservare la piastra a sei pozzetti in un incubatore a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%.

Aggiungere 20 nanogrammi per millilitro di EGF e 20 nanogrammi per millilitro di bFGF a ciascun pozzetto ogni giorno per otto giorni. Ogni tre giorni, aggiungere 200 microlitri di terreno N2 per mantenere circa due millilitri di terreno. Ecco un'immagine delle neurosfere dopo otto giorni.

In questa procedura, raccogli le neurosfere e trasferiscile in un nuovo tubo conico da 15 millimetri. Centrifugare la provetta a 145 volte g per cinque minuti. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere le neurosfere con 0,5 millilitri di tampone di dissociazione. Incubarli con 0,5 millilitri di tampone di dissociazione per cinque minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per dissociare le neurosfere in singole cellule.

Pipettare delicatamente la soluzione campione su e giù meno di cinque volte e centrifugare la provetta a 145 volte g per cinque minuti. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere le neurosfere con un millilitro di terreno N2. Dopo aver rivestito una piastra a sei pozzetti con laminina PLL, piastra le celle a 2,5 x 10⁵ celle per millilitro con due millilitri di terreno N2 per pozzetto. Mantenere le cellule staminali neurali adulte SCZ con un trattamento quotidiano di fattori di crescita per cinque giorni prima di eliminarle.