Generazione di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando bioreattori monouso

Seminare cellule staminali pluripotenti indotte umane, o iPSC, in un bioreattore. Le iPSC vengono risospese in un terreno contenente un inibitore dell'apoptosi cellulare.

Sotto un campo magnetico, la ruota verticale del bioreattore ruota a una velocità controllata, facilitando il contatto cellula-cellula e la formazione dell'aggregato. Rimuovere la maggior parte del terreno e aggiungere nuovi terreni senza l'inibitore.

Continua a coltivare. Una volta che gli aggregati raggiungono una dimensione ottimale, lasciarli sedimentare per gravità. Rimuovere il mezzo.

Aggiungere i terreni di differenziazione contenenti fattori di crescita e la coltura con una velocità ridotta della ruota del bioreattore. I fattori di crescita promuovono la differenziazione neurale all'interno degli aggregati.

Successivamente, aggiungere un terreno fresco integrato con fattori di crescita e chemochine che inducono lo sviluppo di progenitori cerebellari.

Gradualmente, i progenitori cerebellari si organizzano in strati distinti all'interno degli aggregati, formando organoidi cerebellari precoci.

Infine, aggiungere un mezzo neuronale contenente specifici fattori neurotrofici.

Questi fattori inducono la maturazione dei progenitori cerebellari in neuroni cerebellari funzionali sinapticamente attivi, generando organoidi maturi.

Il giorno 1, dove il giorno 0 è il giorno della semina del bioreattore, posizionare il bioreattore e l'unità di base in una cappa a flusso sterile. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere un campione da 1 millilitro della sospensione cellulare. Piastra la sospensione della cella in una piastra a 24 pozzetti con attacco ultrabasso. Utilizzare un microscopio per confermare che si sono formati aggregati derivati da iPSC. In tal caso, acquisire immagini degli aggregati a 40x o 100x.

Continuare a coltivare le iPSC nel bioreattore fino a quando il diametro medio degli aggregati è di 100 micrometri. Quindi, sostituire l'80% del terreno con mTesR1 fresco senza inibitore ROCK. Quando gli aggregati raggiungono i 200-250 micrometri di diametro, lasciare che tutti gli organoidi si depositino sul fondo del bioreattore. Quindi, sostituisci tutto il mezzo esaurito con il mezzo di differenziazione gfCDM.

Posizionare l'unità base e il bioreattore nell'incubatore e ridurre l'agitazione a 25 giri/min.