JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 6:18 min • July 8th, 2025
Prendete un cervello di topo perfuso contenente un tumore.
La fase di perfusione rimuove le cellule immunitarie circolanti ma mantiene le cellule infiltrate nel tumore.
Isolare il tessuto contenente il tumore.
Ora, dissociare meccanicamente il tessuto.
La forza meccanica allenta il tessuto, liberando le cellule.
Trasferire il tessuto dissociato in una provetta.
Centrifugare ed eliminare il surnatante contenente detriti.
Risospendere il tessuto in una soluzione digestiva contenente collagenasi e DNasi.
La collagenasi degrada la matrice extracellulare, liberando le cellule. La DNasi degrada il DNA contaminante.
Aggiungere un tampone per fermare l'attività enzimatica.
Filtrare la sospensione per rimuovere gli aggregati cellulari e ottenere una sospensione a cellula singola.
Centrifugare ed eliminare il surnatante.
Risospendere le cellule in un mezzo gradiente ad alta densità. Ora, sovrapponi con un mezzo di gradiente a densità inferiore, formando un gradiente di separazione con un'interfaccia chiara.
Centrifugare per separare gli strati. Le cellule immunitarie si riuniscono all'interfaccia tra i mezzi di gradiente mentre i detriti cellulari galleggiano in cima.
Raccogli le cellule immunitarie per ulteriori analisi.
In questa procedura, utilizzando una lama di rasoio pulita e a taglio singolo, isolare l'area del cervello, contenente il tumore, praticando un taglio sagittale al centro del cervello per dividere in due i due emisferi. Capovolgere l'emisfero omolaterale con il lato mediale verso il basso e praticare un taglio coronale al cervelletto e un altro taglio al bulbo olfattivo per isolare il tessuto bersaglio contenente l'impianto tumorale.
Quindi, posizionare il tessuto bersaglio nel macinatore di fazzoletti in vetro etichettato, contenente 1 millilitro di DPBS. Spingi lo stantuffo fino in fondo e ruotalo sette volte per interrompere il tessuto. Dopodiché, sollevare lo stantuffo per consentire al liquido di depositarsi sul fondo del macina fazzoletti. Ripeti questo passaggio tre volte. Tuttavia, ruotare lo stantuffo solo quattro volte durante le due ripetizioni successive e tre volte durante l'ultima ripetizione per evitare di triturare eccessivamente il tessuto cerebrale.
Successivamente, applicare tre volumi da 1 millilitro di DPBS ghiacciato ai lati dello stantuffo per sciacquare la materia cerebrale residua nel macinatore di tessuti. Quindi, risospendere la materia cerebrale triturata pipettandola su e giù e metterla in una provetta da centrifuga da 15 millilitri etichettata su ghiaccio. Sciacquare i lati del macina tessuti DAPS con un ulteriore 1 millilitro di DPBS ghiacciato e aggiungere alla stessa provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Conservare tutte le provette contenenti materia cerebrale triturata sul ghiaccio, fino a quando tutti i campioni non sono stati elaborati. Quindi, far girare la materia cerebrale triturata nelle provette da centrifuga da 15 millilitri a 740 volte g per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere la materia cerebrale pellettata in 1 millilitro di una miscela precedentemente preparata di collagenasi e enzimi digestivi DNasi I.
Posizionare le provette da centrifuga da 15 millilitri in un rack per provette e posizionare il rack in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti, quindi agitare delicatamente i campioni due volte durante il periodo di incubazione muovendo le provette per facilitare la disgregazione dei tessuti.
Successivamente, aggiungere 6 millilitri di DPBS ghiacciato a ciascun tubo per diluire gli enzimi digestivi. Pipettare su e giù per risospendere e filtrare il volume totale attraverso filtri sterili a rete di nylon da 70 micron in nuove provette da centrifuga da 15 millilitri etichettate su ghiaccio.
Successivamente, far girare la sospensione delle cellule cerebrali verso il basso a 740 volte g per 20 minuti a 4 gradi Celsius per ottenere un pellet a cellula singola. Togliete le provette da 15 millilitri dalla centrifuga e mettetele sul ghiaccio. Quindi, aumentare l'impostazione della temperatura sulla centrifuga a circa 21 gradi Celsius in preparazione per il passaggio successivo.
Quindi, rimuovere completamente il surnatante cellulare e risospendere inizialmente i pellet cellulari in 1 millilitro di terreno di centrifugazione con densità al 70%, utilizzando una micropipetta P1000. Quindi, aggiungere altri quattro millilitri di terreno di centrifugazione con densità al 70% a ciascuna provetta. Mettere i tappi in modo sicuro e omogeneizzare la sospensione cellulare capovolgendo delicatamente il tubo più volte.
Successivamente, trasferisci le provette da centrifuga da 15 millilitri, contenenti cellule cerebrali risospese in un mezzo di centrifugazione con densità del 70% dal ghiaccio a una provetta a temperatura ambiente. Uno alla volta, sovrapporre con cura 2 millilitri di soluzione di terreno di centrifugazione con densità al 37% sui 5 millilitri di terreno di centrifugazione con densità al 70% per formare un'interfaccia pulita tra i due strati di terreno di centrifugazione a densità.
Quindi, segnare la posizione dell'interfaccia tra i due strati con un pennarello a punta fine in modo che possa essere facilmente identificata dopo la centrifugazione quando la distinzione diventa meno evidente. Centrifugare le provette da centrifuga da 15 millilitri a 740 volte g per 20 minuti a temperatura ambiente senza interruzioni per evitare di interrompere l'interfaccia tra gli strati dei mezzi di centrifugazione a densità.
Successivamente, raccogliere le PBMC che si sono accumulate all'interfaccia tra i due strati di terreno di centrifugazione a densità introducendo una micropipetta P200 nella provetta, bypassando accuratamente lo strato lipidico. Una volta raggiunto il livello della banda PBMC, estrarre lentamente 200 microlitri dalla superficie dello strato di terreno di centrifugazione a densità del 70% e trasferirlo in una provetta FACS in polipropilene rispettivamente etichettata su ghiaccio. Ripetere questo passaggio una volta per ottenere un volume totale di 400 microlitri per campione.