JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 2:16 min. • July 8th, 2025
Prelevare una piastra multipozzetto rivestita con una matrice extracellulare o ECM.
In pozzetti separati, introdurre cellule staminali pluripotenti umane non transgeniche e transgeniche, o hPSC, in un terreno di coltura.
Le hPSC transgeniche trasportano un transgene sotto un promotore inducibile da antibiotici. Il transgene codifica per un fattore di trascrizione che induce la differenziazione neurale.
Incubare per facilitare l'adesione delle cellule alla MEC. Piccole molecole nel mezzo prevengono l'apoptosi, promuovendo la proliferazione cellulare.
Aggiungere una soluzione di distacco per dissociare le cellule, aggiungere il terreno per fermare la dissociazione e quindi trasferirle su un'altra micropiastra rivestita di ECM per consentire la proliferazione cellulare.
Introdurre un mezzo di differenziazione neurale contenente piccole molecole sulle cellule non transgeniche e l'antibiotico induttore sulle cellule transgeniche.
Le piccole molecole inducono le cellule non transgeniche a differenziarsi in cellule progenitrici neurali o NPC. Nelle cellule transgeniche, l'espressione indotta dagli antibiotici del fattore di trascrizione attiva i geni necessari per la differenziazione in NPC.
Mantenere gli NPC in coltura per le applicazioni a valle.
Per la generazione di progenitori e neuroni neuronali non transgenici, o hNeuroni, vedere il giorno 14 progenitori neurali derivati da hPSC in piastre a sei pozzetti rivestite di ECM con 2 millilitri di mezzo neurale e Y27632 per pozzetto.
Se si lavora con iNeurons inducibili dalla doxiciclina, aggiungere un mezzo neurale contenente doxiciclina quando le cellule sono confluenti per circa il 35% per indurre la differenziazione e attivare l'espressione genica. Dopo due giorni, alimentare linee transgeniche e non transgeniche con 2 millilitri di mezzi neurali per pozzetto al giorno. Continuare fino a quando le celle sono pronte a sollevarsi al 70% di confluenza.