Generazione di cellule simili a cellule di Schwann da cellule stromali del midollo osseo
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:58 min • July 8th, 2025
Inizia con una coltura aderente di cellule stromali del midollo osseo.
Sottoporre le cellule all'ipossia, una condizione caratterizzata da ridotti livelli di ossigeno, per la durata richiesta.
Isolare le cellule precondizionate dall'ipossia, quindi centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule nei mezzi progenitori neuronali contenenti fattori di crescita neuronali.
Trasferire le cellule in una piastra di coltura a basso attaccamento e incubarle.
Il precondizionamento dell'ipossia e i fattori di crescita neuronale inducono la differenziazione delle cellule stromali nei progenitori neuronali.
La superficie della placca a basso attaccamento mantiene i progenitori in sospensione, facilitandone la proliferazione e l'aggregazione in neurosfere tridimensionali.
Raccogliere le neurosfere, centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in terreni di induzione gliale contenenti fattori di crescita specifici per la glia.
Trasferire le neurosfere in una piastra di coltura rivestita con laminina, un componente della matrice extracellulare, e poli-D-lisina, un polimero sintetico caricato positivamente.
La superficie rivestita favorisce l'adesione cellulare, facilitando l'adesione alla neurosfera.
I fattori di crescita glia-specifici stimolano la differenziazione dei progenitori neuronali in cellule simili alle cellule di Schwann che mostrano la caratteristica morfologia affusolata delle cellule di Schwann.
Per il precondizionamento ipossico, rilasciare prima l'anello clamp e pulire le parti esposte con etanolo al 70%. Inoltre, smontare la camera di ipossia in componenti e posizionarli in una cappa a flusso laminare per la sterilizzazione sotto luce UV per 15 minuti.
Successivamente, lavare una coltura di MSC confluente dall'80% al 90% con 10 millilitri di PBS, come appena dimostrato, e trattare le colture con terreno di crescita MSC fresco integrato con HEPES da 25 millimolari. Posizionare la coltura trattata nella camera di ipossia riassemblata e serrare il morsetto ad anello. Sigillare le estremità di collegamento della camera per garantire che non vi siano perdite di gas e lavare una miscela di gas di azoto al 99% e ossigeno all'1% nella camera a una portata di 10 litri al minuto.
Dopo cinque minuti, posizionare la camera nell'incubatore per colture cellulari per 16 ore. La mattina successiva, staccare le celle come appena dimostrato e raccoglierle mediante centrifugazione. Risospendere il pellet nel terreno progenitore neurale e seminare 6 x 103 cellule per centimetro quadrato su piastre a sei pozzetti a basso attaccamento per la loro coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 12 giorni.
Al giorno 6-7 dovrebbero essere osservate sfere di cellule considerevoli e non aderenti, con più neurosfere evidenti nelle colture condizionate da ipossia rispetto a quelle sotto normossia entro i giorni 10-12. Il giorno 12, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire le neurosfere in una provetta conica da 15 millilitri e raccogliere le neurosfere mediante centrifugazione.
Risospendere le sfere in DMEM/F12 e piattare da 5 a 10 neurosfere per centimetro quadrato su piastre a sei pozzetti rivestite di poli-D-lisina laminina in 1,5 millilitri di terreno di induzione gliale per pozzetto. Mantenere la coltura cellulare a sfera per almeno sette giorni, rinfrescando il terreno ogni tre giorni.
Panoramica
Questo studio analizza la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo in progenitori neuronali e cellule simili alle cellule di Schwann in condizioni di ipossia. La metodologia prevede un precondizionamento in condizioni di ipossia, seguito dalla coltura in specifici mezzi di coltura per favorire la crescita e la differenziazione cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- Le cellule stromali del midollo osseo possono differenziarsi in vari tipi cellulari.
- È noto che l'ipossia influisce sul comportamento e sulla differenziazione delle cellule staminali.
- I fattori di crescita neuronali sono fondamentali per lo sviluppo dei progenitori neuronali.
- La coltura di neurosfere tridimensionali potenzia la proliferazione cellulare.
Scopo dello studio
- Studiare gli effetti dell'ipossia sulla differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo.
- Valutare il potenziale di queste cellule di trasformarsi in progenitori neuronali e in cellule simili alle cellule di Schwann.
- Stabilire un metodo affidabile per generare questi tipi cellulari in vitro.
Metodi Utilizzati
- Precondizionamento in condizioni di ipossia delle cellule stromali del midollo osseo.
- Isolamento e risospensione delle cellule in mezzo di coltura per progenitori neuronali.
- Coltura delle cellule su piastre a basso attaccamento per la formazione di neurosfere.
- Induzione della differenziazione gliale mediante mezzo di induzione gliale su piastre rivestite.
Risultati principali
- Le cellule precondizionate all'ipossia hanno mostrato una differenziazione potenziata in progenitori neuronali.
- Neurosferoidi si sono formati in maggiore abbondanza in condizioni ipossiche rispetto a condizioni normossiche.
- Cellule di tipo cellule di Schwann hanno mostrato una morfologia caratteristica dopo l'induzione gliale.
- Sono stati stabiliti metodi efficaci per la coltura e la differenziazione di neurosferoidi.
Conclusioni
- L'ipossia è una strategia di precondizionamento vantaggiosa per la differenziazione delle cellule staminali.
- Lo studio fornisce un quadro per la generazione di tipi cellulari neuronali e gliali da cellule stromali.
- Applicazioni future potrebbero includere la medicina rigenerativa e la ricerca in neurobiologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo metodo consente la generazione di cellule simili a cellule di Schwann a partire da cellule stromali del midollo osseo, fornendo una fonte scalabile per la modellizzazione delle malattie del sistema nervoso periferico e applicazioni nella medicina rigenerativa. Il condizionamento in ipossia migliora l'efficienza della differenziazione, supportando la validazione degli obiettivi nei modelli di dolore neuropatico e di lesione nervosa. L'approccio favorisce la riduzione del rischio meccanicistica producendo cellule gliali pertinenti alla malattia per lo screening preclinico e la scoperta di biomarcatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle interazioni glia-neuronali in modelli di patologia del nervo periferico.
- Valore operativo: Fornisce una fonte rinnovabile di cellule simili a cellule di Schwann per studi sull'interazione con bersagli.
- Valore predittivo: Permette la validazione funzionale di bersagli coinvolti nei percorsi di demielinizzazione e rimielinizzazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cellule gliali con morfologia caratteristica per schermature basate su saggi di composti neuroprotettivi.
- Valore operativo: La formazione di neurosfere consente la produzione scalabile e riproducibile di progenitori pronti per la differenziazione.
- Prontezza per i saggi: L'adesione a superfici rivestite con laminina/poli-D-lisina supporta un'allestimento standardizzato per saggi di risposta ai farmaci.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Le cellule simili a cellule di Schwann modellano la funzione gliale periferica in modelli di lesione neuropatica e di malattie demielinizzanti.
- Continuità traslazionale: Collega l'approvvigionamento di cellule stromali a fenotipi gliali rilevanti per studi sulla rigenerazione del nervo periferico.
- De-risking predittivo: Permette una valutazione precoce degli effetti dei composti sulla differenziazione gliale e sul potenziale di mielinizzazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta convertendo cellule stromali mesenchimali accessibili in cellule della linea gliale per lo screening di bersagli e fenotipi successivi.
- Biologia della scoperta: Il precondizionamento in ipossia aumenta il rendimento di progenitori, favorendo una validazione scalabile di bersagli nelle vie gliali.
- Screening: La coltura di neurosfere consente l'espansione e la conservazione di progenitori per la preparazione di cellule pronte all'uso negli assay.
- Analisi: Parametri morfologici e basati su marcatori permettono la quantificazione dell'efficienza di differenziazione ai fini dello screening di composti.
- Ricerca traslazionale: Le cellule simili a cellule di Schwann generate supportano la valutazione preclinica di strategie di rimielinizzazione in modelli di nervo periferico.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo può essere adattato a diversi donatori di MSC e a diverse condizioni di induzione gliale per un riutilizzo della piattaforma nella scoperta di neurofarmaci.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce la dipendenza dai neuroni gliali primari fornendo una fonte cellulare strofale differenziabile.
- Valore operativo: Condizioni definite di mezzo e rivestimento migliorano la riproducibilità tra laboratori e siti.
- Valore strategico: Permette decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla capacità di differenziazione gliale e sulla modulazione del bersaglio in cellule rilevanti per la malattia.
- Impatto sul portafoglio: Sostiene investimenti calibrati sui rischi per bersagli del sistema nervoso periferico attraverso modelli cellulari validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella gestione dell'ipossia e nelle tecniche di differenziamento gliale.
- È dipendente da infrastrutture per camere ipossiche e sistemi sterili di miscelazione di gas per il precondizionamento.
- Necessita di protocolli standardizzati di rivestimento con laminina e poli-D-lisina per garantire un'adesione costante delle neurosfere.
- L'adattamento a diverse fonti di cellule staminali mesenchimali può richiedere l'ottimizzazione della durata dell'ipossia e delle concentrazioni dei fattori di crescita.
- È limitato dalla necessità di tempi di coltura prolungati (12 o più giorni) e da un attento monitoraggio della formazione e del differenziamento delle neurosfere.
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026