Isolamento di neuroni DRG e cocoltura con precursori cellulari di Schwann per generare cellule di Schwann

Prendi il midollo spinale di un embrione di ratto con gangli della radice dorsale attaccati, o DRG, contenenti neuroni e cellule gliali.

Staccare i singoli DRG dal cavo, trasferirli in una provetta e centrifugare, scartando eventuali detriti di tessuto.

Aggiungere enzimi per dissociare i neuroni DRG e le cellule gliali.

Gira le celle e rimuovi eventuali detriti. Aggiungere un terreno di mantenimento neuronale e triturare per generare una sospensione a cellula singola.

Trasferire la sospensione in una micropiastra rivestita con un substrato di coltura, favorendo l'adesione cellulare.

Introdurre un terreno di purificazione e incubare. Gli agenti inibitori del mezzo eliminano le cellule gliali in divisione mentre i neuroni che non si dividono sopravvivono.

Prendi le cellule simili alle cellule di Schwann, o SCLC, in un terreno di co-coltura. Le SCLC, il precursore delle cellule di Schwann, interagiscono con i neuroni dei nervi periferici embrionali.

Introdurre la sospensione sui neuroni DRG e incubare. L'interazione degli SCLC con i neuroni DRG promuove la loro maturazione in cellule di Schwann.

Le celle di Schwann generate sono pronte per l'analisi.

Per raccogliere i gangli della radice dorsale, trasferire il primo embrione in una piastra di coltura di 10 centimetri contenente PBS a temperatura ambiente sotto un microscopio da dissezione in posizione prona e inserire una pinza per microdissezione lungo entrambi i lati del midollo spinale.

Usando la dissezione smussata, separare il midollo spinale dai tessuti molli circostanti, usando una pinza per asportare il midollo spinale lungo l'apertura del collo e il troncone della coda. Rimuovere il tessuto molle residuo dal midollo spinale liberato fino a quando rimangono solo il midollo spinale, le radici nervose e il ganglio della radice dorsale attaccato.

Staccare i singoli gangli della radice dorsale dalle loro radici nervose di collegamento. Quindi, utilizzare una penna per pipette dotata di una punta per pipetta da 1 millilitro per trasferire fino a 100 gangli radicolari dorsali in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri di PBS.

Raccogliere i gangli mediante centrifugazione e risospendere i pellet in 200 microlitri di reagente di dissociazione cellulare enzimatica ricombinante per provetta. Dopo 10 minuti a 37 gradi Celsius, centrifugare nuovamente i gangli della radice dorsale utilizzando una punta di pipetta da 200 microlitri per triturare delicatamente i pellet nel terreno di mantenimento dei neuroni postgangliari della radice dorsale.

Seminare le cellule gangliari della radice dorsale a 5 x 10³ cellule per centimetro quadrato su piastre a sei pozzetti rivestite di poli-D-lisina laminina in 1,5 millilitri di terreno di mantenimento dei neuroni del ganglio della radice dorsale per pozzetto.

Dopo due giorni di coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO₂, lavare le cellule e rimettere le colture cellulari neuronali nell'incubatore in un terreno di purificazione fresco dei neuroni del ganglio della radice dorsale per altri due giorni.

Dopo 3 o 4 cicli di mantenimento e purificazione, le colture di cellule gangliari della radice dorsale devono risultare positive per il marcatore neuronale Tuj-1 e negative per il marcatore delle cellule gliali S100 beta.

Il giorno 7 della coltura cellulare simile a cellule di Schwann, sciacquare le cellule in PBS, seguito da dissociazione con 0,5 millilitri di reagente di dissociazione cellulare enzimatica ricombinante per pozzetto a 37 gradi Celsius per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in terreno di co-coltura e seminare le cellule simili a cellule di Schwann sulla coltura purificata di neuroni gangliari della radice dorsale a 1 x 10³ cellule per centimetro quadrato per 14 giorni di co-coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO₂.