Replating di neuroni differenziati derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Inizia con una grande piastra di coltura contenente neuroni differenziati derivati da cellule staminali pluripotenti umane con una fitta rete neuronale.

Incubare questi neuroni con lievi enzimi proteolitici per staccarli dalla piastra, sollevandoli come un foglio.

Con l'incubazione continua, gli enzimi interrompono parzialmente le connessioni cellulari, allentando le reti neuronali.

Aggiungere un terreno di coltura per fermare l'attività enzimatica.

Pipettare ripetutamente i neuroni staccati per separarli l'uno dall'altro.

Filtra i neuroni attraverso un colino cellulare per rimuovere i grumi di cellule e raccogliere i singoli neuroni.

Centrifugare e rimuovere il surnatante. Risospendili in un mezzo di crescita.

Per il replating, seminare questi neuroni su un polimero e una piastra multipozzetto rivestita di proteine di adesione. Incubare per consentire il loro attaccamento.

I neuroni utilizzano i nutrienti del mezzo per rimanere vitali. Sostituire regolarmente il terreno di coltura per mantenere i livelli di nutrienti.

Incubare ulteriormente per consentire la maturazione neuronale e la formazione di connessioni tra di loro.

Inizia risciacquando delicatamente la piastra di neuroni differenziati con PBS. Disperdere il PBS lungo la parete della piastra e non direttamente sulle cellule per evitare di distruggerle. Aspirare il PBS dal bordo del piatto mentre lo si ribalta, facendo attenzione a non toccare le cellule.

Applicare almeno 1 millilitro di enzima proteolitico per piastra da 10 centimetri e rimettere le cellule nell'incubatore per 40-45 minuti. Durante l'incubazione, controllare i neuroni su un microscopio a contrasto di fase e continuare il trattamento con proteasi fino a quando la rete neurale non si stacca completamente dalla piastra e inizia a rompersi. Quando i neuroni si sono staccati, interrompere la digestione aggiungendo 5 millilitri di terreno DMEM fresco per ogni 1 millilitro di proteasi.

Utilizzare una pipetta sierologica per triturare delicatamente le cellule contro la piastra da 5 a 8 volte, assicurandosi di non applicare troppa pressione. Filtrare le cellule attraverso una maglia di 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri goccia a goccia e sciacquare il colino con altri 5 millilitri di terreno DMEM fresco.

Utilizzare una centrifuga da banco per far girare le celle verso il basso a 1.000 volte g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, rimettere la provetta conica nella cabina di biosicurezza e aspirare la maggior parte del terreno, lasciando 250 microlitri per mantenere umide le cellule. Risospendere delicatamente le cellule in 2 millilitri di terreno DMEM fresco e farle passare attraverso l'estremità di una pipetta sierologica da 5 millilitri.

Infine, capovolgere il tubo 2 o tre volte. Utilizzare un emocitometro e un blu di tripano per contare le cellule vitali, quindi diluire le cellule con DMEM fresco alla concentrazione desiderata. Aggiungere gli integratori appropriati alla provetta a seconda delle esigenze della specifica linea cellulare e mescolare delicatamente le cellule inclinando la provetta conica 2 o 3 volte.

Aspirare il rivestimento di laminina da una piastra a 24 pozzetti e risciacquare una volta con PBS. Aspirare il PBS e applicare la soluzione cellulare su ciascun pozzetto con un movimento a forma di otto per evitare la formazione di grumi. Al termine della placcatura delle celle, rimettere la piastra nell'incubatore impostata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.