Sviluppo di organoidi nervosi motori derivati da iPSC umane utilizzando un chip microfluidico

Prendiamo le cellule staminali pluripotenti indotte umane, o iPSC, in un terreno di cellule staminali ricco di sostanze nutritive con inibitori della Rho-chinasi.

Gli inibitori entrano nelle cellule e bloccano gli enzimi Rho-chinasi, prevenendo la morte cellulare apoptotica.

Le cellule utilizzano i nutrienti per proliferare e aggregarsi spontaneamente per formare un ammasso cellulare tridimensionale chiamato sferoide.

A poco a poco, sostituisci il mezzo con un mezzo di induzione neurale. I modulatori di segnalazione provenienti dal mezzo guidano la differenziazione delle cellule staminali in cellule neurali.

Sostituire con un mezzo neurale ricco di fattori di crescita per differenziare le cellule sferoidi in motoneuroni e formare uno sferoide motoneurone o MNS.

Trasferire questi MNS in un chip microfluidico rivestito di polimero contenente un mezzo di maturazione.

I fattori di crescita nervosi nel mezzo stimolano gli assoni o le proiezioni più lunghe dei neuroni a crescere dallo sferoide e ad estendersi attraverso il microcanale del chip.

Questo forma un organoide nervoso motore, un modello tridimensionale del tessuto nervoso motore.

Per indurre la differenziazione delle cellule iPS 3D nei motoneuroni, seminare 4 x 10^{cellule da 4} iPS per pozzetto nel numero appropriato di pozzetti di una piastra con fondo a U da 96 pozzetti in 100 microlitri di alimentatore e terreno di coltura cellulare privo di siero integrato con 10 micromolari Y27632.

Il giorno successivo, sostituire il surnatante in ogni pozzetto con 100 microlitri di terreno KSR integrato con 10 micromolari SB-431542 e 100 nanomolari LDN-193189. Nei giorni 2 e 3, sostituire i surnatanti con 100 microlitri di terreno KSR integrati con 10 micromolari SB-431542, 100 nanomolari LDN-193189, 5 micromolari DAPT, 5 micromolari SU-5402, 1 acido retinoico micromolare e un agonista levigato micromolare. Nei giorni 4 e 5, sostituire i surnatanti con una miscela di 75% di terreno KSR e 25% di terreno N2, integrati con 10 micromolari SP-431542, 100 nanomolari LDN-193189, 5 micromolari DAPT, 5 micromolari SU-5402, 1 acido retinoico micromolare e 1 agonista levigato micromolare.

Nei giorni 6 e 7, sostituire i surnatanti con una miscela del 50% di terreno KSR e del 50% di terreno N2, integrati con 5 DAPT micromolari, 5 SU-5402 micromolari, 1 acido retinoico micromolare e 1 agonista levigato micromolare. Nei giorni 8 e 9, sostituire i surnatanti con una miscela del 25% di terreno KSR e del 75% di terreno N2, integrata con 5 DAPT micromolari, 5 SU-5402 micromolari, 1 acido retinoico micromolare e 1 agonista levigato micromolare. Nei giorni 10 e 11, sostituire i surnatanti con terreno N2 integrato con 5 DAPT micromolari, 5 SU-5402 micromolari, 1 acido retinoico micromolare e 1 agonista levigato micromolare. Il giorno 12, sostituire i surnatanti in ogni pozzetto con 100 microlitri di terreno di maturazione, integrati con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello per pozzetto.

Per indurre la formazione di organoidi nervosi motori, sostituire la soluzione di rivestimento nel chip PDMS con 150 microlitri di terreno di maturazione integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e utilizzare una punta per micropipetta a foro largo per aggiungere delicatamente gli sferoidi dei motoneuroni da un pozzetto della piastra a 96 pozzetti all'ingresso del microcanale del chip. Posizionare un piccolo serbatoio di acqua sterile vicino al chip di coltura tissutale nella piastra per evitare l'evaporazione media e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Ogni due o tre giorni, sostituire metà del terreno di coltura esaurito dal centro del serbatoio del terreno con un terreno di maturazione fresco integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello. Gli assoni cresceranno dallo sferoide del motoneurone nel canale, assemblandosi spontaneamente in un singolo fascio per un periodo di due o tre settimane per formare un organoide nervoso motore.