Generazione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali di topo con il metodo della goccia sospesa

Prendi una sospensione di cellule staminali embrionali di topo.

Centrifugare, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un mezzo di differenziazione neurale.

Posizionare le goccioline della sospensione sul lato interno del coperchio di una piastra di coltura.

Aggiungere un tampone alla piastra inferiore per evitare che le goccioline si secchino. Posizionare il coperchio sulla piastra inferiore, formando una coltura a goccia pendente, e incubare.

A causa della gravità, le cellule si raggruppano e formano aggregati tridimensionali chiamati corpi embrioidi o EB.

Posizionare le goccioline in una piastra contenente il mezzo di differenziazione e incubare sotto agitazione per la crescita degli EB.

Centrifugare e rimuovere il terreno; risospendere gli EB nel terreno di differenziazione integrato con acido retinoico, trasferirli in una piastra di coltura e incubarli.

L'acido retinoico entra nelle cellule e innesca la formazione di un complesso di trascrizione. Il complesso induce l'espressione genica, innescando la differenziazione in cellule progenitrici neurali.

Gli EB differenziati sono pronti per le applicazioni a valle.

Inizia impostando la coltura cellulare a goccia sospesa. Per una piastra di coltura cellulare da 10 centimetri, regolare la concentrazione a 500 cellule per 20 microlitri di terreno di differenziazione. Preparare una quantità sufficiente di sospensioni cellulari per 50 goccioline da 20 microlitri. Utilizzare una micropipetta o una pipetta a ripetizione per posizionare goccioline da 20 microlitri di sospensione cellulare sul coperchio di una piastra di coltura tissutale, assicurandosi che le goccioline non siano troppo vicine tra loro per evitare che si fondano.

Riempi il piatto con 5-10 millilitri di PBS e rimetti con cura il coperchio sul piatto. Incubare la coltura nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo due giorni, raccogliere le goccioline dal coperchio e metterle in una piastra di sospensione per colture cellulari di 10 centimetri, riempita con 10 millilitri di terreno di differenziazione. Quindi, posizionare la piastra su un agitatore orbitale impostato a bassa velocità nell'incubatrice. Dopo altri due giorni, centrifugare le cellule a 200 volte g per tre minuti e rimuovere il surnatante.

Per indurre la differenziazione del corpo embrioide in cellule progenitrici neurali, risospendere le cellule nel mezzo di differenziazione con acido retinoico 5-micromolare. Incubare la piastra per due giorni. Quindi, sostituire almeno metà del terreno con un terreno nuovo inclinando la piastra e pipettandola verso l'esterno.