Silenziamento genico mediato da siRNA nelle cellule staminali neurali

Prendiamo il piccolo RNA interferente, o siRNA, un tipo di RNA coinvolto nel silenziamento genico.

Aggiungi vescicole lipidiche sferiche chiamate liposomi.

Il liposoma incapsula il siRNA, proteggendolo dalla degradazione.

Aggiungere complessi siRNA-liposomi a un pozzetto di coltura contenente cellule staminali neurali. Tenerne uno bene come controllo e incubare.

Il liposoma si fonde con la membrana cellulare, rilasciando il siRNA.

Il siRNA si lega al complesso di silenziamento indotto dall'RNA, o RISC, dove viene rimosso un filamento.

Il filamento rimanente prende di mira l'mRNA responsabile della differenziazione cellulare, portandone la degradazione.

Aggiungere un mezzo di differenziazione adatto ai pozzetti.

Nel pozzo di controllo, i fattori di crescita e altri nutrienti nel terreno promuovono la differenziazione delle cellule staminali neurali in osteoblasti.

Utilizzando tecniche di colorazione adeguate, colorare i marcatori specifici degli osteoblasti sulle cellule e colorare il nucleo con un colorante fluorescente blu.

L'assenza di marcatori specifici per gli osteoblasti nelle cellule silenziate dal gene indica la loro incapacità di differenziarsi.

Per eseguire il knockdown dei siRNA nelle cellule O9-1, recuperano e seminano le cellule. Diluire i liposomi in un volume appropriato di terreno privo di siero. Quindi, diluire il siRNA in terreni privi di siero secondo il protocollo di testo. Successivamente, aggiungere il siRNA diluito ai liposomi diluiti secondo le istruzioni del produttore. Miscelare la soluzione mediante pipettaggio e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, aggiungi un volume appropriato di complesso siRNA-lipidi alle cellule. Quindi, incubare le cellule per 24 ore in un incubatore per colture cellulari standard. Le cellule O9-1 possono differenziarsi in diversi tipi di cellule in specifiche condizioni di coltura di differenziazione. Per differenziare le cellule O9-1 in osteoblasti, preparare i terreni di differenziazione osteogenica secondo il protocollo di testo. Infine, rilevare il marcatore osteoblastico osteocalcina in osteoblasti differenziati mediante immunocolorazione.