Una tecnica per generare cellule progenitrici neurali da cellule staminali embrionali di topo

Prendere cellule staminali embrionali di topo, o mESC, sospese in un mezzo di differenziazione, e incubarle.

Nella coltura in sospensione, le mESC si aggregano per formare una struttura chiamata corpi embrioidi o EB.

Gli EB sono aggregati tridimensionali che imitano un embrione in via di sviluppo e possono essere differenziati in cellule neurali.

Trasferire gli EB in un tubo e lasciarli depositare per gravità.

Rimuovere il terreno impoverito di nutrienti, risospendere gli EB in un terreno fresco e trasferirli in un piatto di coltura.

Incubare la coltura in sospensione per facilitare la crescita degli EB.

Trasferire gli EB sospesi nel fluido su una piastra multipozzetto. I pozzetti sono rivestiti con una proteina di adesione, che consente agli EB di attaccarsi.

Introdurre l'acido retinoico, che entra nelle cellule e innesca la formazione di un complesso di trascrizione.

Il complesso induce l'espressione genica, promuovendo la differenziazione delle cellule in cellule progenitrici neurali, o NPC, che mostrano processi cellulari estesi.

Aggiungere 1,5 milioni di cellule staminali embrionali di topo in una capsula batterica non adesiva in 10 millilitri di terreno di differenziazione basale e incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per consentire la formazione del corpo embrioide.

Dopo due giorni, trasferire gli aggregati cellulari in provette da centrifuga da 15 millilitri e lasciarli depositare per gravità. Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 millilitri di terreno di differenziazione basale fresco per risospendere i corpi embrioidi. Quindi, ripiantali in un nuovo piatto non adesivo e incubali per altri due giorni.

Raccogliere e seminare circa 50 corpi embrioidi in 2 millilitri di terreno di differenziazione basale per pozzetto su una piastra a sei pozzetti rivestita di gelatina. Per l'induzione dell'acido retinoico, aggiungere 2 microlitri di brodo RHA in ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di 1 micromolare. Rimetti la piastra nell'incubatrice e differenzia le cellule per altri quattro giorni.