Un metodo modificato del tubo a rullo per la coltura a lungo termine di fette di cervello di roditore

Prendi fette di cervello ottenute da un cervello di roditore. Le fette sono costituite dall'ippocampo, che contiene i neuroni dell'ippocampo.

Trasferisci le fette di cervello su vetrini coprioggetti contenenti plasma di pollo.

Applicare il plasma mescolato con trombina sulle fette. La trombina induce la coagulazione plasmatica, creando un'impalcatura biologica che favorisce l'adesione delle fette ai vetrini.

Prendi tubi a rullo a lato piatto con un foro sul lato piatto e un disco adesivo attaccato attorno al foro all'esterno dei tubi.

Posizionare i vetrini coprioggetti sui dischi adesivi, assicurandosi che le fette di cervello siano rivolte verso l'interno delle provette.

Aggiungere un terreno di coltura neuronale alle provette e far fluire in una miscela di anidride carbonica e aria.

Tappare le provette, inserirle in una griglia a rulli e incubarle con un movimento rotatorio.

L'aerazione fornita dall'incubazione a rotazione e i nutrienti del terreno supportano la coltura a lungo termine delle fette di cervello.

Per iniziare, preparare la cremagliera del tubo del rullo e creare una maschera per facilitare la perforazione di un foro nei tubi del rullo, come descritto nel protocollo di testo allegato. Usando la maschera, tieni in posizione una provetta di plastica di plastica da 1 centimetro con il lato piatto in modo che il lato piatto sia rivolto verso l'alto. Quindi, praticare un foro di 6 millimetri di diametro con il centro a 1 centimetro dal fondo e centrato tra i lati del tubo.

Con l'utensile di sbavatura girevole, levigare i bordi del foro e praticare quattro scanalature sul bordo interno del foro per facilitare lo scarico del foro durante la rotazione. Quindi, sciacquare i tubi con etanolo al 70% e asciugarli all'aria in una cappa di sicurezza biologica. Sterilizzare i tubi in alcuni dischi di gomma siliconica adesiva perforata da 12 millimetri per 40 minuti sotto la lampada UV.

Dopo 20 minuti, riposizionare i tubi e i dischi in modo che tutte le superfici esposte siano sterilizzate. Quindi, staccare il supporto bianco dal disco adesivo. Allineare i fori e fissare la gomma siliconica all'esterno del tubo.

Una volta ottenute le fette, posizionare 2 microlitri di plasma di pollo al centro del lato fotoinciso di un vetrino coprioggetti preparato. Stendere leggermente il plasma per ottenere un punto di 3-4 millimetri di diametro. Quindi, usa una spatola sterile a punta stretta per sollevare una fetta di cervello preparata. Usa una pinza chiusa per mantenere la fetta sulla punta della spatola mentre sollevi la fetta. Toccare con la spatola la macchia di plasma sul vetrino coprioggetti e, con la pinza chiusa, spingere la fetta sul vetrino coprioggetti.

Aggiungere un sottile strato di plasma di pollo sul vetrino coprioggetti prima di posizionare la fetta e una quantità minima di plasma trattato con trombina per coprire la fetta. Se la fetta galleggia, non rimarrà aderente quando il coagulo viene rimosso.

Successivamente, mescolare 2,5 microlitri di plasma e 2,5 microlitri di trombina in una provetta separata. Posizionare rapidamente 2,5 microlitri di questa miscela sopra e intorno alla fetta e pipettare delicatamente su e giù per mescolarla. Rimuovere la copertura di plastica trasparente dal lato esposto dell'adesivo in gomma siliconica precedentemente fissato al tubo del rullo. Quindi, posiziona il vetrino coprioggetti con la fetta di cervello sull'adesivo, allineando la fetta all'interno del foro.

Per garantire l'adesione, applicare una pressione morbida e uniforme sul vetrino coprioggetti con il pollice premendo uniformemente il vetrino coprioggetti verso il basso e tenendolo premuto per circa 1 minuto durante il trasferimento nella cabina di sicurezza biologica.

La pressione sul vetrino coprioggetti per farlo aderire al tubo senza perdite deve essere giusta e mantenuta abbastanza a lungo da eliminare i canali d'aria nel sigillante. Troppa pressione romperà il vetrino.

In una cabina di sicurezza biologica, aggiungere 0,8 millilitri di terreno di coltura neurobasale A completo a ciascuna provetta. Quindi, far passare una miscela di anidride carbonica al 5% e aria al 95% attraverso una pipetta sterile da pascolo con tappo di cotone e tenuta saldamente da una pinza. Utilizzare questa funzione per lavare il tubo del rullo con la miscela di gas e tappare rapidamente il tubo quando viene estratto dalla pipetta.

Quindi, etichettare le provette con il numero della fetta e il numero del rack. Inserire le provette in una cremagliera a rulli, assicurandosi che siano bilanciate geometricamente. Se c'è un numero dispari di tubi, aggiungere tubi vuoti per bilanciare.

Posizionare le griglie in un'incubatrice a rulli a 35 gradi Celsius con i rulli che ruotano la cremagliera a rulli per mantenere il fluido sul fondo delle provette. Inclinare l'incubatrice all'indietro di circa 5 gradi sollevando la parte anteriore su una tavola.