Generazione di neuroni riprogrammando le cellule dei fibroblasti dermici umani

Introdurre fibroblasti dermici umani adulti o aHDF, sospesi in un mezzo di fibroblasto, in una micropiastra rivestita di proteine della matrice extracellulare. Incubare per consentire l'adesione cellulare.

Introdurre un vettore lentivirale transgenico. Dopo l'internalizzazione nella cellula ospite, l'RNA virale viene trascritto inversamente in DNA, che si integra nel genoma ospite.

Il DNA virale esprime fattori di trascrizione e RNA a forcina corta, o shRNA. Le nucleasi cellulari trasformano gli shRNA in piccoli RNA interferenti o siRNA.

I siRNA generati degradano l'mRNA codificante i repressori trascrizionali, inibendo così la loro espressione e consentendo l'attivazione dei geni di differenziazione neuronale.

I fattori di trascrizione attivano i geni, promuovendo la differenziazione neuronale degli aHDF.

Rimuovere il mezzo contenente i vettori non internalizzati.

Aggiungere un mezzo di conversione neuronale precoce contenente fattori di crescita e piccole molecole che inducono la differenziazione in cellule simili ai neuroni.

Sostituire il terreno con un mezzo di conversione neuronale tardiva contenente fattori neurotrofici per la maturazione in neuroni.

I neuroni maturi sono pronti per i saggi a valle.

Preparare una sospensione cellulare di 1.320.000 cellule in 13,2 millilitri di terreno fibroblastico per ottenere 100.000 cellule per millilitro di terreno. Dopo aver aspirato la gelatina dalla piastra, lavare due volte la piastra con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco. Quindi, aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare a ciascuno dei pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per una notte.

Scaldare 13,2 millilitri di terreno fibroblastico a 37 gradi Celsius. Quindi, scongelare il vettore lentivirale nella cappa laminare a temperatura ambiente. Aggiungere al mezzo il volume richiesto di lentivirus necessario per infettare i fibroblasti dermici umani adulti con una molteplicità di 20 infezioni senza alcun potenziatore di trasduzione.

Quindi, sostituire il terreno con 500 microlitri di terreno per fibroblasti con l'aggiunta del vettore lentivirale. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, sostituire il terreno contenente lentivirus con un terreno fresco di fibroblasti senza il vettore lentivirale. Il terzo giorno dopo la trasduzione virale, rimuovere il terreno fibroblastico e aggiungere 500 microlitri di terreno di conversione neuronale precoce.

Due o tre volte alla settimana, sostituire 225 microlitri di terreno vecchio da ciascun pozzetto con 250 microlitri di terreno di conversione neuronale fresco e precoce. Il 18° giorno dopo la trasduzione virale, rimuovere il terreno di conversione neuronale precoce e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo di conversione neuronale tardiva. Continuare a cambiare il terreno ogni due o tre giorni come prima fino al 25° giorno o al punto finale sperimentale.