Generazione e mantenimento di colture di fette da tessuto di glioblastoma umano

0 visualizzazioni4:13 min • July 8th, 2025

Prendiamo il glioblastoma umano, un tumore cerebrale primario originato dalle cellule gliali.

Lavare il fazzoletto utilizzando un mezzo di lavorazione ghiacciato per rimuovere il sangue residuo.

Tagliare il fazzoletto a pezzi e inserirlo in uno stampo da inclusione contenente agarosio fuso.

Raffreddare lo stampo, permettendo all'agarosio di polimerizzare e formare una matrice di gel stabile.

Rimuovere il blocco di tessuto dallo stampo e fissarlo sulla piastra del campione di un vibratomo.

Aggiungere il mezzo di lavorazione ghiacciato per immergere il blocco. Passare una miscela di gas ossigenato per aerare il terreno, mantenendo la vitalità dei tessuti.

Sezionare il tessuto tumorale incorporato in fette sottili.

Trasferire una fetta in una capsula di Petri contenente il mezzo di lavorazione ghiacciato per preservare l'architettura tissutale.

Quindi, piastrate la fetta di tessuto su un inserto a membrana permeabile in un pozzetto contenente un terreno di mantenimento della coltura a fette.

Mantenere la fetta in condizioni fisiologiche. La coltura a fette è pronta per i saggi a valle.

Iniziare utilizzando una pinza sterile per posizionare gli inserti di coltura in PTFE vuoti in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente 1 millilitro di terreno di mantenimento della coltura a fette per pozzetto. Una volta aggiunti tutti gli inserti, posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale umidificato con camicia d'acqua a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Quindi, posizionare i pezzi di tessuto tumorale in una capsula di Petri contenente un terreno di lavorazione ghiacciato e utilizzare una pipetta per lavare delicatamente il tessuto tre volte con terreno fresco per rimuovere eventuali globuli rossi aderenti. Dopo il terzo lavaggio, utilizzare un bisturi per tagliare i pezzi di tumore in strisce di circa 3 x 3 x 10 millimetri, rimuovendo con cura tutti i vasi attaccati ed evitando tessuti necrotici o cauterizzati.

Quando tutto il tessuto è stato tagliato, aggiungi da 5 a 7 millilitri di agarosio liquido a 37 gradi Celsius in uno stampo di plastica da 2 centimetri cubi e raffredda l'agarosio su un letto di ghiaccio per un minuto. Posizionare da 2 a 4 strisce di tessuto nell'agarosio, con l'asse lungo orientato verticalmente, lasciando i tessuti in ghiaccio per altri 2-5 minuti dopo il loro posizionamento.

Quando l'agarosio si è solidificato, tagliare i lati della forma con un bisturi per rimuovere delicatamente l'agarosio dallo stampo e utilizzare una generosa goccia di colla cianoacrilica per fissare il blocco di agarosio a una piastra per campioni di vibratomo.

Quando la colla si è solidificata, immergere il blocco di agarosio in un terreno di lavorazione ghiacciato e utilizzare una pipetta di plastica sterile tagliata per far bollire una miscela al 5% di CO2 95% O2 nel terreno all'interno del serbatoio del vibratomo. Impostare lo spessore della fetta del vibratomo da 300 a 350 micron e regolare la velocità avanzata della lama e l'ampiezza della lama in base alla consistenza del tessuto e alle specifiche del vibratomo.

Ottenere il numero appropriato di fette in base all'analisi sperimentale pianificata. Utilizzando una micro-spatola in acciaio inossidabile per trasferire le fette in una capsula di Petri contenente un mezzo di lavorazione ghiacciato man mano che vengono acquisite. Quando tutte le fette sono state acquisite, utilizzare la micro-spatola per trasferire ogni fetta su un singolo inserto in PTFE.

Dopo un'incubazione di 12-24 ore, equilibrare una nuova piastra a sei pozzetti contenente il terreno di mantenimento della coltura a fette fresche nell'incubatore per colture cellulari per 15 minuti. Quindi utilizzare una pinza sterile per afferrare ciascun inserto per il bordo e trasferire gli inserti nei singoli pozzetti della nuova piastra a sei pozzetti.

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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026