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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:02 min • July 8th, 2025
Inizia con le gliomasfere, aggregati cellulari derivati da un tumore cerebrale o glioblastoma.
Aggiungere enzimi di dissociazione. Incubare per separare le cellule del glioblastoma e ottenere una sospensione unicellulare.
Successivamente, introdurre un terreno di coltura arricchito con siero per fermare l'attività enzimatica.
Centrifugare e rimuovere il surnatante, quindi risospendere le cellule.
Filtrare la sospensione, quindi centrifugare e rimuovere il surnatante.
Risospendere le cellule nei precursori dell'idrogel che contengono piccoli peptidi.
Caricare questa miscela nei pozzetti con uno stampo in silicone preassemblato contenente acido ialuronico.
Mescola la soluzione. Incubare per consentire l'interazione tra l'acido ialuronico e i precursori dell'idrogel, formando un idrogel che facilita l'intrappolamento cellulare.
Sovrapporre l'idrogel con terreni di coltura per sostenere la sopravvivenza cellulare.
Dopo aver smontato lo stampo, incubare l'idrogel.
All'interno dell'idrogel, le proteine di adesione sulle cellule interagiscono con i peptidi precursori e l'acido ialuronico.
Questo fa sì che le cellule formino piccoli grappoli e sviluppino una coltura tridimensionale.
Per iniziare, posizionare stampi in gomma siliconica puliti e asciutti in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti non trattata con coltura tissutale e utilizzare l'estremità smussata pulita di una punta di pipetta per far aderire gli stampi al fondo della piastra. Dopo aver controllato la tenuta tra gli stampi e il fondo del pozzetto, raccogliere le sfere di glioma dissociate da una coltura cellulare di glioblastoma mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di enzima di dissociazione cellulare.
Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, agitare il tubo picchiettando delicatamente e arrestare la reazione enzimatica con quattro millilitri di terreno completo. Centrifugare nuovamente le celle e risospendere il pellet in un millilitro di terreno fresco completo prima di filtrare le celle attraverso un filtro da 70 micrometri. Lavare il filtro con altri quattro millilitri di terreno completo e dividere la sospensione in due aliquote da 8 x 104 celle per provetta da centrifuga.
Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere un pellet in 80 microlitri di polietilenglicole maleimmide appena preparato, o PEG-Mal-RGD, e un pellet in 80 microlitri di soluzione PEG-Mal-CYS appena preparata per stampo. Utilizzando un puntale per micropipetta a orifizio largo da 200 microlitri, aggiungere 40 microlitri di soluzione di acido ialuronico in ogni stampo in silicone di gomma, seguiti da 40 microlitri di soluzione cellulare PEG-Mal-CYS o PEG-Mal-RGD, pipettando rapidamente su e giù non più di 10 volte per stampo da miscelare.
A causa del rapido tempo di gelificazione, una volta miscelati i due componenti dell'idrogel, è importante utilizzare una punta per pipette a orifizio largo per miscelare le soluzioni in modo rapido ma accurato. Questo passaggio richiede pratica.
Quindi, posizionare le cellule incapsulate in gel in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 5-10 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere da 2 a 2,5 millilitri di terreno di coltura a ciascun gel e utilizzare una punta di pipetta sterile da due microlitri e una pinza per separare delicatamente i gel dai lati degli stampi. Quindi, utilizzare una pinza sterilizzata per rimuovere gli stampi dai pozzetti della piastra e rimettere la piastra nell'incubatore cellulare.