JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 5:12 min • July 8th, 2025
Inizia con un cervello di cucciolo di topo.
Isolare il cervelletto e ottenere fette di tessuto di spessore adeguato.
Trasferire le fette su inserti a membrana posizionati all'interno di pozzetti della piastra di coltura contenenti terreni.
Nei pozzetti trattati, il terreno contiene un composto di prova neuroprotettivo. I pozzi di controllo mancano del composto. Incubare.
In condizioni di controllo, le cellule cerebellari di Purkinje vanno incontro ad apoptosi, imitando lo sviluppo postnatale precoce in vivo.
Nei pozzetti trattati, a seconda del suo potenziale, il composto può proteggere le cellule dall'apoptosi.
Lavate le fette e fissatele per preservarne l'integrità cellulare.
Trasferire le fette in una soluzione che blocca la permeabilizzazione per permeabilizzare le membrane cellulari e bloccare i siti di legame non specifici.
Sovrapposizione con anticorpi primari che hanno come bersaglio una proteina legante il calcio specificamente espressa nelle cellule di Purkinje.
Lavare e introdurre anticorpi secondari coniugati con fluorofori che hanno come bersaglio gli anticorpi primari.
Controcolorare i nuclei con un colorante legante il DNA e montare le fette.
Utilizzando un microscopio confocale, quantificare le cellule di Purkinje vitali per identificare il potenziale neuroprotettivo del composto in esame
Per raccogliere il cervelletto, usa una pinza per medicazione dritta per afferrare la testa del cucciolo per il naso e usa le forbici per gli occhi dritte per tagliare il cuoio capelluto dall'estremità posteriore lateralmente alla linea mediana. Taglia il cranio allo stesso modo, puntando le punte delle forbici verso l'esterno per evitare di danneggiare il cervelletto, e usa una spatola per trasferire il cervello in un piatto da 60 millimetri contenente HBSS freddo e 5 milligrammi per millilitro di glucosio.
Usa la pinza per medicazione diritta per sezionare con cura il cervelletto e usa una pinza fine curva sterile per posizionare il tessuto su un disco di plastica sul tavolo da taglio di un tritatessuti. Ruotare il piano di taglio per orientare il tessuto in modo da consentire l'acquisizione di sezioni parasagittali e tirare la manopola di rilascio del tavolo verso destra per spostare il piano di taglio fino a posizionare la lama sul bordo del tessuto. Quindi, regolare lo spessore della fetta a 350 micrometri e la velocità della lama a media e avviare il tritatutto. Quando l'intero cervelletto è stato affettato, spegni il tritatutto.
Usando una pinza sterile, tieni il disco su un nuovo piatto da 60 millimetri. Utilizzare una pipetta di trasferimento per lavare l'HBSS più glucosio sul disco in modo che le fette cadano nel piatto. Quindi, toccando i campioni il meno possibile, utilizzare una microsonda per separare le fette.
Utilizzare la pipetta di trasferimento per selezionare le sezioni del cervelletto vicino al verme sui singoli inserti di coltura cellulare nella piastra a sei pozzetti e utilizzare la microsonda per posizionare le fette al centro di ciascun inserto. Quando tutte le fette sono state posizionate, aspirare con cura l'eccesso di HBSS e glucosio e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari.
Per la colorazione in immunofluorescenza, rimuovere il surnatante da ciascun pozzetto e lavare gli inserti con PBS. Fissare le fette con 1 millilitro di paraformaldeide fredda al 4% nel pozzetto di ogni inserto e 500 microlitri sopra ogni inserto per 1 ora.
Al termine del fissaggio, lavare gli inserti quattro volte per 10 minuti con 1 millilitro di PBS fresco sotto ogni inserto e 500 microlitri di PBS fresco sopra ogni inserto per lavaggio su uno shaker orbitale. Preriempire ogni pozzetto di una piastra da 24 pozzetti con 500 microlitri di PBS-TB e utilizzare un pennello per trasferire le fette cerebellari da ciascun inserto di coltura cellulare nei singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
Permeabilizzare e bloccare le fette a temperatura ambiente per un'ora. Al termine dell'incubazione, etichettare le cellule con 200 microlitri dell'anticorpo primario di interesse diluito in PBS-TB per pozzetto per notte a 4 gradi Celsius sull'agitatore orbitale.
La mattina successiva, lavare le fette quattro volte per 10 minuti e 500 microlitri di PBS fresco per lavaggio sull'agitatore prima di etichettare i campioni con gli appropriati anticorpi secondari coniugati con fluorofori per due ore a temperatura ambiente sull'agitatore al riparo dalla luce.
Al termine dell'incubazione, controcolorare le sezioni con 500 microlitri di un colorante nucleare appropriato per pozzetto per 10 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce e utilizzare una pipetta di trasferimento per montare le fette su vetrini.
Quindi, lasciare asciugare completamente le sezioni all'aria prima di reidratarle con PBS e montare i fazzoletti con vetrini coprioggetti rivestiti con circa 80 microlitri di terreno di montaggio. Una volta che il mezzo di montaggio si è indurito, le sezioni cerebellari sono pronte per essere visualizzate.