Generazione di una coltura di organoidi da una sospensione di cellule tumorali cerebrali

Inizia con una provetta da microcentrifuga contenente una matrice extracellulare ricca di laminina o lrECM. La laminina è un componente strutturale presente in abbondanza nel cervello.

Tenere il tubo sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione IrECM.

Aggiungere le cellule tumorali cerebrali e mescolare accuratamente per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.

Successivamente, trasferire il composto su stampi in parafilm, formando delle goccioline.

Incubare per facilitare la polimerizzazione della lrECM per formare un'impalcatura, imitando l'ambiente naturale delle cellule.

Ora, sciacquare gli organoidi solidificati in una capsula di Petri contenente un terreno di coltura, quindi incubare.

Il terreno di coltura fornisce nutrienti essenziali e fattori di crescita, supportando la divisione cellulare.

All'interno dell'organoide, le cellule si auto-organizzano migrando e invadendo.

Dopo l'incubazione, inclinare la piastra per depositare gli organoidi.

Rimuovere con cura il terreno in eccesso e aggiungere il terreno fresco.

Incubare agitando delicatamente.

Questo distribuisce i nutrienti in modo uniforme e migliora la crescita degli organoidi.

Per produrre organoidi da una sospensione di una singola cellula, aggiungere una quantità appropriata di matrice extracellulare ricca di laminina o lrECM in una piccola provetta da centrifuga in un secchiello per il ghiaccio o in un blocco freddo.

Preparare una miscela di cellule contenente 20.000 cellule per organoide. Mescolare accuratamente la miscela di sospensione cellulare lrECM per evitare la sedimentazione delle cellule, che provocherebbe una formazione non uniforme di organoidi. Quindi, pipettare con cura 20 microlitri di miscela su uno stampo in parafilm per formare una gocciolina simile a una perla. Assicurarsi di raffreddare il puntale della pipetta ogni due o tre organoidi per evitare la polimerizzazione della lrECM.

Una volta che il numero desiderato di organoidi è stato pipettato sullo stampo in parafilm in una piastra di coltura di 10 centimetri, incubare gli organoidi a 37 gradi Celsius per 1 o 2 ore in un incubatore per colture cellulari. Dopo che gli organoidi si sono solidificati, sciacquare delicatamente gli organoidi dallo stampo in parafilm con il terreno NBMC utilizzando una punta P1000 e raccoglierli in una nuova piastra di coltura da 10 centimetri contenente 20 millilitri di NBMC. Mettere la piastra di coltura in un'incubatrice senza agitare per 4 giorni.

Dopo 4 giorni, sostituire il supporto nella piastra. Per fare ciò, posizionare un pezzo di carta scura sotto la piastra di coltura cellulare. Inclinare la piastra e attendere 20 secondi. Quando gli organoidi si depositano completamente sul fondo del piatto, rimuovere lentamente il terreno con una pipetta di vetro ad apertura larga.

Dopo aver aggiunto il nuovo terreno, posizionare la piastra nell'incubatore su un agitatore orbitale a 80 giri/min e successivamente sostituire il terreno ogni 2 o 3 giorni.