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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:08 min • July 8th, 2025
Iniziare con colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate su una matrice di membrana basale aderente.
Aggiungere un mezzo di differenziazione cerebellare contenente un ormone specifico, un fattore di crescita e inibitori di piccole molecole.
Sollevare le colonie con una pipetta di vetro e trasferirle su una piastra di fissaggio ultrabassa.
La superficie a basso attaccamento mantiene le cellule in sospensione, facilitando la loro aggregazione in corpi embrioidi tridimensionali, o EB.
L'ormone, il fattore di crescita e gli inibitori si legano ai rispettivi siti bersaglio, promuovendo la differenziazione delle cellule staminali in progenitori neuronali.
Trasferire gli EB in pozzetti su piastre di coltura rivestite con un polimero sintetico e una proteina di adesione per facilitare l'adesione degli EB.
Sostituire il mezzo con un mezzo di differenziazione privo di inibitori.
Le cellule iniziano a migrare verso l'esterno dagli EB, formando un monostrato 2D.
Rimuovere il terreno e aggiungere un mezzo di maturazione cerebellare.
I fattori di crescita nel mezzo inducono la maturazione dei progenitori neuronali in distinti precursori neuronali cerebellari.
Il giorno zero, aggiungere 1 millilitro di terreno di differenziazione cerebellare integrato con 10 micromolari Y27632 e SB431542 a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti con attacco ultra-basso o ULA e posizionarlo nell'incubatrice fino a quando le colonie sollevate non sono pronte per essere aggiunte ai pozzetti. Pulire le cellule differenziate utilizzando una pipetta di vetro estratta. Aspirare il terreno e aggiungere 1 millilitro di soluzione di passaggio iPSC per ogni piatto da 35 millimetri.
Dopo tre minuti di incubazione a 37 gradi Celsius, aspirare il terreno e aggiungere 2 millilitri di terreno di differenziazione cerebellare integrato con 10 micromolari Y27632 e SB431542. Con l'ingrandimento 4X di un microscopio a luce trasmessa invertita, sollevare le colonie utilizzando il bordo piegato della pipetta di vetro estratta. Una volta sollevata ogni colonia, trasferire delicatamente tutte le colonie in un pozzetto della piastra ULA a 6 pozzetti utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri. Ripetere questo processo per ogni piastra iPSC e incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Il giorno 2, aggiungere FGF2 a ciascun pozzetto per regolare una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro. Il giorno 7, cambiare un terzo del terreno aspirando 1 millilitro di terreno esaurito e sostituendolo con 1 millilitro di terreno di differenziazione cerebellare fresco. Incubare i corpi embrioidi per sette giorni.
Il giorno 14, fai roteare la piastra per raccogliere tutti i corpi embrioidi al centro della piastra. Quindi, inclinare la piastra e aspirare tutto il terreno esaurito utilizzando un pipettatore da 1000 microlitri dal bordo. Man mano che la quantità di terreno diminuisce, stendere lentamente la piastra e continuare ad aspirare, lasciando abbastanza terreno per evitare di seccare i corpi embrioidi.
Successivamente, aggiungere 3 millilitri di terreno di differenziazione cerebellare fresco integrato con 10 micromolari. Y27632. Quindi, trasferire i corpi embrioidi utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri in un piatto rivestito di poli-L-Ornitina laminina. Il giorno 15, aspirare il terreno e sostituirlo con un terreno di differenziazione cerebellare fresco.