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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:48 min • July 8th, 2025
Inizia con frammenti di tessuto del tronco encefalico contenenti glioma pontino intrinseco diffuso, un tumore derivato da cellule progenitrici gliali in un ambiente ricco di nervi mielinizzati.
Trattare con enzimi proteolitici per degradare la matrice extracellulare del tessuto.
Dopo l'incubazione, pipettare ripetutamente il contenuto per facilitare la dissociazione cellulare e la degradazione della guaina mielinica.
Filtro e centrifuga per la raccolta delle cellule. Rimuovere il surnatante e risospenderli in un tampone freddo.
Aggiungere una soluzione di saccarosio per la separazione del gradiente di densità e mescolare accuratamente.
Successivamente, centrifugare per separare le cellule più pesanti dai detriti di mielina più leggeri.
Rimuovere lo strato di mielina e aggiungere un tampone di lisi dei globuli rossi.
Aggiungere un tampone freddo per arrestare l'azione di lisi. Centrifugare e rimuovere il surnatante per eliminare i globuli rossi lisati.
Risospendere le cellule in un mezzo neurobasale caldo e coltivarle in un pallone non rivestito.
L'assenza di fattori neurotropi provoca la morte neuronale, mentre le cellule progenitrici gliali utilizzano nutrienti e fattori di crescita, portando alla proliferazione. Aggiungere un terreno fresco per mantenere i livelli del fattore di crescita.
Nel corso del tempo, queste cellule si aggregano spontaneamente in gruppi di cellule, formando neurosfere fluttuanti.
In questa procedura, centrifugare la provetta conica contenente i frammenti di tessuto rimanenti per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione di digestione enzimatica preriscaldata in modo tale che ci siano 5 millilitri di soluzione di digestione per ogni 1 millilitro di tessuto. Quindi, sigillare il coperchio della provetta conica con pellicola da laboratorio e incubare la reazione su un rotatore a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, triturare delicatamente i campioni. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, pipettare il campione su e giù per 6-8 volte ed evitare di generare eccessive bolle d'aria. Quindi, aggiungere un puntale per pipetta da 1000 microlitri all'estremità della pipetta e triturare il campione per altre 6-8 volte.
Lasciare che i pezzi rimanenti si depositino sul fondo del tubo. Quindi, rimuovere e filtrare il surnatante con la cellula ancora sospesa attraverso un filtro da 100 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri etichettato con dissociazione enzimatica e conservarlo su ghiaccio. Successivamente, centrifugare la provetta di dissociazione enzimatica per cinque minuti e continuare con la centrifugazione in gradiente di saccarosio. Se il campione è ancora sospeso in soluzione, centrifugarlo per cinque minuti.
Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il tessuto in 20 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio. Quindi, portare il volume fino a 25 millilitri con HBSS freddo. Lentamente, aggiungere 25 millilitri di soluzione di saccarosio 1,8 molari e capovolgere il tubo per mescolare. Ciò si traduce in un gradiente di saccarosio molare di 0,9 molari.
Successivamente, centrifugare il campione senza interruzioni per 10 minuti. Aspirare con cura i detriti di mielina e quanta più soluzione di saccarosio possibile. Quindi, lavare il campione aggiungendo 30 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio e mescolando delicatamente. Dopodiché, centrifugare per cinque minuti.
In questa procedura, rimuovere il surnatante di lavaggio. Aggiungere 5 millilitri di tampone di lisi ACK e risospendere delicatamente il pellet cellulare, facendo roteare la provetta per un minuto a temperatura ambiente. Quindi, spegnere la lisi aggiungendo 30 millilitri di HBSS freddo senza calcio e magnesio.
Successivamente, centrifugarlo per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare finale in 10-15 millilitri di TSM completo caldo con fattori di crescita e quantificare la densità cellulare vitale su un emocitometro utilizzando l'esclusione del blu di tripano. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare finale in un nuovo pallone di coltura T75. Aggiungere ulteriori fattori di crescita a giorni alterni per mantenere i livelli complessivi dei fattori di crescita e monitorare lo sviluppo delle neurosfere delle cellule tumorali.