Isolamento e coltura di progenitori di neuroni granulari cerebellari murini

Prendi il cucciolo di topo cerebella.

Omogeneizzali in frammenti più piccoli.

Aggiungere un enzima proteolitico per digerire la matrice extracellulare del tessuto, allentando i progenitori granulari cerebellari, o CGNP, e gli astrociti.

Aggiungere terreni di coltura CGNP contenenti siero per arrestare l'attività enzimatica. Centrifugare e scartare il surnatante ricco di enzimi.

Risospendere i frammenti di tessuto in terreno CGNP. Dissociare meccanicamente il tessuto per rilasciare le cellule.

Una volta che i detriti si sono depositati, trasferire il surnatante contenente le cellule in una nuova provetta.

Centrifugare e rimuovere il surnatante con i detriti.

Risospendere le cellule in terreno CGNP e seminarle su pozzetti a piastre multipozzetto rivestiti con poli-D-lisina. Incubare.

Gli astrociti si depositano e aderiscono fortemente al rivestimento di poli-D-lisina, rispetto ai CGNP.

Agitare la piastra e raccogliere il surnatante contenente CGNP. Centrifugare e rimuovere il surnatante.

Risospendere i CGNP in terreno CGNP e seminarli su una piastra multipozzetto rivestita di poli-L-ornitina. Incubare.

I CGNP si attaccano alla superficie rivestita e proliferano, aiutati dai componenti del terreno e dalla poli-L-ornitina.

Trasferire da tre a cinque cervelletti in provette da 15 millilitri. Lavare la cerebella con glucosio HBSS prima della centrifugazione. Centrifugare le provette per raccogliere il tessuto. Dopo il lavaggio finale, omogeneizzare la cervelella pipettando delicatamente su e giù due o tre volte con una pipetta da 1 millilitro fino a quando i frammenti non hanno una dimensione compresa tra 0,5 e 1 millimetro cubo.

Rimuovere delicatamente tutto il liquido fino a quando non rimangono 2,5 millilitri. Quindi, aggiungere lo 0,05% di tripsina nella provetta con glucosio HBSS contenente il cervelletto e incubare il tessuto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Capovolgere il tessuto ogni 1 o 3 minuti. Dopo l'incubazione, interrompere la digestione aggiungendo 5 millilitri di terreno di coltura cellulare cGMP o CGM e raccogliere il tessuto mediante centrifugazione come prima.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere 1 millilitro di CGM. Triturare il tessuto con il puntale della pipetta da 1 millilitro, evitando la formazione di bolle d'aria. Quindi, aggiungi 5 millilitri di CGM e incuba la miscela per due minuti sul ghiaccio per depositare i resti di tessuto. Una volta che il tessuto si è depositato, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 15 millilitri. Quindi, aggiungere 2 millilitri di CGM al tessuto residuo e ripetere la procedura di triturazione prima di raccogliere il surnatante e scartare i resti di tessuto.

Raccogliere i surnatanti da ogni provetta da 15 millilitri di tessuto e centrifugare per raccogliere le cellule cerebellari. Risospendere il pellet in 10 millilitri di CGM. Poiché gli astrociti aderiscono più velocemente e più forte alla poli-D-lisina rispetto ai cGMP, aggiungere fino a 4 millilitri di sospensione cellulare ai pozzetti delle piastre a 6 pozzetti rivestite di poli-D-lisina e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius per rimuovere gli astrociti.

Agitare il piatto. Raccogliere il surnatante in una provetta da 15 millilitri, quindi centrifugare il surnatante come prima. Risospendere il pellet in 10 millilitri di CGM e contare le celle con una camera di conteggio Neubauer. Dopo 4-6 ore, le cGMP aderenti appaiono rotonde e proliferanti. Seminare le cellule in CGM su piastre rivestite di poli-L-ornitina e incubare a 37 gradi Celsius, 5% CO₂ e 100% di umidità relativa.