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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:00 min • July 8th, 2025
Iniziare con colonie di cellule staminali pluripotenti umane o hPSC attaccate a un substrato adatto in un terreno di coltura.
Rimuovere il mezzo. Aggiungere un mezzo neuronale contenente inibitori specifici e incubare.
Questi inibitori dirigono la maturazione delle hPSC verso una linea neuronale, formando colonie neuroectodermiche. Questi sono precursori di piccole strutture sferiche chiamate sferoidi.
Rimuovere il terreno e lavare con un tampone di sale.
Incubare con un enzima digestivo per staccare le colonie dalla piastra.
Aggiungere il mezzo neuronale per fermare l'attività enzimatica.
Raccogli le colonie e trasferiscile in un tubo.
Lasciali depositare, quindi scarta il surnatante.
Risospendere le colonie in un mezzo neuronale contenente un fattore di crescita.
Trasferire le colonie in una piastra a più pozzetti e incubare.
Questo fattore di crescita facilita l'auto-organizzazione e la moltiplicazione delle cellule neuroectodermiche, portandole a formare uno sferoide.
Per iniziare, piastrate le colonie di hPSC su una matrice di membrana basale qualificata hESC da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti alla confluenza del 60% in tre pozzetti per ottenere una densità dal 20% al 30%, quindi procedete con l'induzione di colonie neuroectodermiche 2D.
Aggiungere quotidianamente terreni freschi di N2 integrati con doppi inibitori SMAD a ciascun pozzetto per i successivi 3 giorni. Per generare sferoidi neuroectodermici 3D da colonie neuroectodermiche 2D indotte, rimuovere 2 millilitri di terreno N2 dalla piastra a 6 pozzetti e lavare una volta con HBSS per assicurarsi che tutto il terreno N2 venga rimosso.
Aggiungere 1 millilitro di dispasi in ogni pozzetto contenente la colonia. Incubare la piastra per 20-25 minuti a 37 gradi Celsius e controllare regolarmente il distacco della colonia. Al termine dell'incubazione, per arrestare l'attività dell'enzima dispasi, aggiungere 1 millilitro di terreno N2 al pozzetto. Utilizzando un puntale per pipetta P1000 a foro largo o un puntale per pipetta P1000 modificato con forbici sterili, trasferire le colonie in una provetta da 15 millilitri e lasciare che i grumi di colonia affondino sul fondo della provetta per gravità.
Quindi, con un puntale per pipetta P1000 standard, rimuovere con cautela il surnatante. Sostituirlo con 1 millilitro di terreno N2 fresco e ripetere il lavaggio tre volte per garantire la completa rimozione della dispasi. Dopo aver risospeso i grumi cellulari e il terreno N2, trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e aggiungere 40 nanogrammi per millilitro di bFGF.