JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:49 min • July 8th, 2025
Inizia con un muscolo della testa di topo e taglialo in frammenti.
Aggiungere un cocktail di enzimi proteolitici e incubare agitando delicatamente.
Gli enzimi digeriscono la matrice extracellulare del tessuto, allentando le fibre muscolari.
Aggiungere terreni contenenti proteine del siero per inattivare gli enzimi.
Trasferire il fazzoletto in una provetta, centrifugare e scartare il surnatante.
Risospendere il tessuto in un terreno. Ripetere la disgregazione meccanica e la centrifugazione due volte per ottenere una sospensione omogenea di cellule satelliti, cellule staminali cruciali per la riparazione e la rigenerazione muscolare.
Raccogli il surnatante contenente la cellula satellite.
Passare attraverso un colino cellulare per ottenere una sospensione a cellula singola. Centrifugare, scartare il surnatante e risospendere le cellule nel terreno.
Posizionare le gocce della sospensione cellulare sui pozzetti di scorrimento della camera rivestiti di proteine della matrice extracellulare.
La superficie rivestita facilita l'attacco delle celle satellitari. Aggiungere il terreno ai pozzetti.
I fattori di crescita nei mezzi inducono la proliferazione e la differenziazione delle cellule satelliti in mioblasti, precursori delle cellule muscolari, che proliferano ulteriormente e si fondono per formare miotubi multinucleati.
I miotubi alla fine maturano in fibre muscolari.
Per isolare le cellule satelliti, trasferire ogni muscolo in pozzetti individuali di una piastra a sei pozzetti e tagliare i tessuti in piccoli pezzi di 2 millimetri, facendo attenzione a non tritare troppo i muscoli. Successivamente, incubare attentamente i frammenti di tessuto in 2,5 millilitri di soluzione di pronasi allo 0,1% per pozzetto a 37 gradi Celsius per 60 minuti, agitando delicatamente, ogni 20 minuti.
Quando i fasci di fibre mostrano un aspetto allentato, aggiungere 2,5 millilitri di DMEM, integrati con siero di cavallo e antibiotici a ciascun pozzetto, e trasferire i tessuti digeriti in singoli tubi conici da 15 millilitri. Centrifugare i fanghi di tessuto e decantare i surnatanti. Quindi, aggiungere 5 millilitri di terreno a ciascuna provetta e omogeneizzare il tessuto con una pipetta di plastica da 10 millilitri.
Centrifugare nuovamente i fazzoletti e trasferire i surnatanti in nuovi tubi conici da 15 millilitri. Quindi, aggiungere altri 5 millilitri di terreno alle provette e triturare nuovamente i pezzi di tessuto fino a quando i frammenti non passano facilmente attraverso la pipetta.
Dopo un'altra centrifugazione, raggruppare i surnatanti nelle provette corrispondenti appropriate e filtrare le sospensioni cellulari attraverso filtri da 40 micrometri in singole provette da 50 millilitri. Lavare i filtri con 1 millilitro di DMEM per il massimo recupero cellulare. Quindi, fai girare le cellule. Risospendere i pellet in terreno fresco e contare le cellule.
Per coltivare le cellule satelliti isolate, quindi, diluire le sospensioni cellulari a 1,5 x 103 cellule per 10 microlitri di terreno di coltura. Quindi, aggiungere 10 microlitri di cellule su ogni punto di gel della matrice extracellulare precedentemente preparato e incubare i gel a 37 gradi Celsius. Dopo sei ore, aggiungere con cautela 400 microlitri di terreno di coltura a ciascun punto di gel e rimettere i vetrini nell'incubatore. Dopo tre giorni, avviare la differenziazione delle cellule con l'aggiunta del terreno di coltura appropriato.