JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 4:02 min • July 8th, 2025
Prendi una sospensione di cellule di carcinoma embrionale di topo in grado di differenziarsi in vari tipi di cellule.
Semina le cellule su una piastra di coltura idrofobica contenente terreni e acido retinoico.
incubare. Le superfici idrofobiche impediscono l'adesione cellulare, causando la formazione di aggregati.
L'acido retinoico entra negli aggregati cellulari, innescando vie di segnalazione e causando la differenziazione in cellule progenitrici neuronali.
Dopo l'incubazione, raccogliere gli aggregati cellulari.
Eliminare il supporto.
Aggiungere terreni contenenti acido retinoico e seminare gli aggregati su un piatto di coltura idrofobo.
incubare. L'acido retinoico facilita la differenziazione cellulare sostenuta nei neuroni.
Raccogliere gli aggregati e rimuovere i file multimediali.
Aggiungere un enzima proteolitico per interrompere le aderenze cellula-cellula all'interno degli aggregati.
Aggiungere terreni contenenti siero per fermare l'attività enzimatica.
Dissociano meccanicamente gli aggregati, formando una sospensione neuronale.
Centrifugare e scartare il surnatante ricco di enzimi.
Risospendere i neuroni in un terreno e seminarli su una piastra aderente a più pozzetti contenente mezzi di comunicazione.
incubare. I neuroni aderiscono alla placca e maturano, estendendo lunghe proiezioni.
Per la generazione di aggregati, iniziare aggiungendo 10 millilitri di terreno di differenziazione integrati con 5 microlitri di AR a un piatto di coltura non trattato da 100 millilitri. Seminare 1 milione di cellule nella capsula di coltura e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per due giorni al fine di promuovere la formazione dell'aggregato.
Dopo l'incubazione, con una pipetta da 10 millilitri, aspirare il terreno contenente gli aggregati e trasferirlo in una provetta da 15 millilitri a temperatura ambiente. Attendere 1,5 minuti affinché gli aggregati si depositino sul fondo, quindi scartare il surnatante.
Aggiungere 10 millilitri di terreno di differenziazione fresco integrato con 0,5 micromolari di AR. Semina delicatamente gli aggregati in un nuovo piatto di coltura non trattato da 100 millimetri e incuba a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due giorni.
Per iniziare, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire gli aggregati cellulari in una provetta da 15 millilitri. Attendere 1,5 minuti a temperatura ambiente affinché gli aggregati si depositino sul fondo, quindi scartare il surnatante. Lavare gli aggregati con siero e DMEM privo di antibiotici. Attendi che gli aggregati cellulari si depositino sul fondo. Scartare il surnatante e aggiungere 2 millilitri di tripsina EDTA allo 0,25%.
Incubare la provetta a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 10 minuti, picchiettando ogni due minuti per mantenere le cellule in sospensione. Quindi, aggiungere 4 millilitri di terreno di mantenimento per fermare l'attività della tripsina e pipettare su e giù 20 volte utilizzando una pipetta da 1 millilitro.
Infine, centrifugare le celle a 200 volte g e temperatura ambiente per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet della cella in 5 millilitri di terreno di mantenimento. Utilizzare un contatore di celle per determinare il numero di celle e procedere con la placcatura delle celle. Per piastrare, per prima cosa, aggiungere 3 millilitri per pozzetto di terreno di mantenimento a una piastra di coltura a sei pozzetti. Quindi, seminare le cellule a una densità di 500.000 per pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.